劉中平 劉小江 吳德模

腦膠質(zhì)瘤(glioma)是位于神經(jīng)外胚層的腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的46%，在顱內(nèi)呈浸潤性生長，主要表現(xiàn)為浸潤性侵犯血管周圍間隙、神經(jīng)纖維束間及軟腦膜，具有侵襲性強及易復發(fā)的特點，是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一[1]。膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制目前尚未完全清楚，通常認為膠質(zhì)瘤的發(fā)生是由促癌基因或抑癌基因共同參與的多因素、多步驟的復雜過程[2]。T-BOX轉(zhuǎn)錄因子2(T-box transcription factor 2，TBX2)是T-BOX基因家族成員之一，其編碼的TBX2蛋白可以作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控胚胎發(fā)育過程[3]。研究發(fā)現(xiàn)，TBX2可通過多種機制促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]。張雁等[5]研究表明，TBX2在卵巢癌等多種腫瘤中表達上調(diào)，是一種新型腫瘤分子標志物。但目前關(guān)于TBX2對腦膠質(zhì)瘤細胞生物學行為的影響研究筆者尚鮮見報道。本研究通過體外培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細胞，探討TBX2對腦膠質(zhì)瘤細胞生物學行為的影響，以期為腦膠質(zhì)瘤的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤細胞U251及正常人星形膠質(zhì)細胞SVG P12均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自賽默飛世爾科技有限公司，慢病毒載體由南京科佰生物科技有限公司設(shè)計并構(gòu)建。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 人腦膠質(zhì)瘤細胞U251接種在含10%的新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔2 d更換一次培養(yǎng)基，取增殖期的細胞，胰蛋白酶消化后接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至細胞融合度70%左右時，將細胞隨機分為3組，TBX2 inhibitor組：轉(zhuǎn)染含TBX2 inhibitor的慢病毒載體；陰性對照組(NC組)：轉(zhuǎn)染攜帶無義序列的慢病毒載體；空白對照組(CK組)：不進行轉(zhuǎn)染。37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集3組細胞。

1.3 qRT-PCR檢測腦膠質(zhì)瘤細胞中TBX2表達水平 取膠質(zhì)瘤細胞500 μl，采用Trizol法提取樣品總RNA，測定RNA純度及濃度后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得cDNA，再以cDNA為模板進行擴增，以GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)體系25 μl，qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃：5 min；94℃：30 s；58℃：45 s；72℃：30 s，共35個循環(huán)。采用2-CT法測量TBX2表達水平。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 細胞增殖檢測 采用CCK-8 法進行檢測，分別將轉(zhuǎn)染48 h的3組細胞分別接種于96孔板，每組細胞設(shè)6個復孔，每孔接種5×103個細胞，在培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、48 h、72 h時加入10 μl CCK8溶液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h后，在450 nm波長處讀取吸光度值(OD值)，并求取平均值。

1.5 細胞遷移情況 采用Transwell細胞遷移實驗進行檢測，收集轉(zhuǎn)染后48 h細胞制備2×103/μl單細胞懸液，取100 μl接種于上室(每組設(shè)3個復孔)，下腔室中加入含有10% FBS條件培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出Transwell小室，吸棄上室液體，用PBS洗2次，95 %乙醇固定10 min，加入0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗2遍，顯微鏡下隨機選取10個視野，觀察并拍照，利用Image J軟件計數(shù)穿膜細胞數(shù)，求取平均值。

1.6 細胞侵襲情況 采用Transwell法進行檢測，檢測過程除加入基質(zhì)膠外，其他步驟與細胞遷移檢測方法相同。

2 結(jié)果

2.1 TBX2在腦膠質(zhì)瘤細胞中的表達情況 腦膠質(zhì)瘤U251細胞TBX2相對表達量顯著高于SVG P12正常細胞(P<0.05)。見表2。

表2 腦膠質(zhì)瘤細胞與正常細胞中TBX2表達比較

注：與SVG P12細胞比較，*P<0.05

2.2 轉(zhuǎn)染后3組腦膠質(zhì)瘤細胞中TBX2表達比較 TBX2 inhibitor組腦膠質(zhì)瘤細胞TBX2相對表達量顯著低于CK組、NC組(P<0.05)。見表3。

表3 轉(zhuǎn)染后各組腦膠質(zhì)瘤細胞中TBX2水平比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與CK組比較，#P<0.05

2.3 轉(zhuǎn)染后3組腦膠質(zhì)瘤細胞增殖情況比較 TBX2 inhibitor組腦膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的OD值均顯著低于CK組、NC組(P<0.05)。見表4。

表4 3組腦膠質(zhì)瘤細胞增殖情況比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與CK組比較，#P<0.05

2.4 轉(zhuǎn)染后各組腦膠質(zhì)瘤細胞遷移情況比較TBX2 inhibitor組腦膠質(zhì)瘤細胞遷移數(shù)目顯著低于CK組、NC組(P<0.05)。見表5，圖1。

2.5 3組腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲情況比較 TBX2 inhibitor組細胞侵襲數(shù)目顯著低于CK組、NC組(P<0.05)。見表6,圖2。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤又稱神腦膠質(zhì)細胞瘤，來源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，由間質(zhì)細胞如神經(jīng)膠質(zhì)及脈絡(luò)叢上皮等形成，是顱內(nèi)常見的一種惡性腫瘤[6]。按病理分級可將腦膠質(zhì)瘤可分為4級，其中Ⅰ級腦膠質(zhì)瘤繁殖能力低，手術(shù)治愈可能性高；Ⅱ級腦膠質(zhì)瘤為浸潤性腫瘤，易復發(fā)，有向高級別腫瘤進展的傾向；Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤具有惡性腫瘤的組織學特點，多數(shù)患者需要接受術(shù)后輔助性放、化療；Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤具有惡性細胞學表現(xiàn)，生長迅速，術(shù)前、術(shù)后進展快，復發(fā)率高，患者術(shù)后需接受輔助性放、化療及生物治療等綜合療法，但目前臨床上仍無法治愈該疾病[7-9]。腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機制是涉及多個基因共同參與的復雜過程。其發(fā)病機制至今尚未完全明確，因此，進一步探索影響腦膠質(zhì)瘤細胞生物學行為的因素十分重要。

表5 3組腦膠質(zhì)瘤細胞遷移情況比較 個，

注：與NC組比較，*P<0.05；與CK組比較，#P<0.05

圖1 3組腦膠質(zhì)瘤細胞遷移情況比較(結(jié)晶紫染色×200)

圖2 3組腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲情況比較(結(jié)晶紫染色×200)

表6 3組腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲情況比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與CK組比較，#P<0.05

TBX2是T-BOX基因編碼轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在心、腎、肺、乳腺間質(zhì)中均有表達，在早期胚胎形成和晚期組織器官的發(fā)育成熟中起著重要的調(diào)控作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，TBX2在腫瘤的發(fā)生過程中具有關(guān)鍵的作用，在黑素瘤等多種惡性腫瘤組織中表達上調(diào)[11]。常方圓等[12]研究表明，TBX2在惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤中表達上調(diào)，可能在惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤U251細胞中TBX2相對表達量顯著高于SVG P12正常人星形膠質(zhì)細胞，提示TBX2在膠質(zhì)瘤細胞中表達上調(diào)，在膠質(zhì)瘤疾病的發(fā)生中可能扮演促癌角色，TBX2表達上調(diào)可能與腦膠質(zhì)瘤疾病的發(fā)生有關(guān)。

隨著分子生物學的發(fā)展，人們對腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機制的研究已經(jīng)深入到基因水平，研究表明，IGF-2、YEGF、HIF-1、MDM2等原癌基因在腦膠質(zhì)瘤組織中表達上調(diào)，而RB、p14、P53、PTEN等抑癌基因在腦膠質(zhì)瘤中由于基因突變或缺失等原因表達受到抑制[13]。研究表明，TBX2能夠參與腦膠質(zhì)瘤的形成與發(fā)展，主要通過表達p14ARF基因或抑制p21基因，導致MDM2過度表達，進而促進細胞增殖[14,15]。本研究結(jié)果顯示TBX2 inhibitor組細胞TBX2相對表達量顯著低于CK組、NC組，提示轉(zhuǎn)染TBX2 inhibitor后，腦膠質(zhì)瘤細胞中TBX2顯著降低，轉(zhuǎn)染效率較高。

TBX2是腫瘤發(fā)生和發(fā)育過程中的重要細胞周期調(diào)節(jié)因子，Nandana等[16]研究表明，TBX2在前列腺癌標本和人類前列腺的異種移植小鼠模型的骨轉(zhuǎn)移中表達上調(diào)，使用顯性失活構(gòu)建體抑制TBX2的表達，可導致腫瘤細胞增殖減少。Wang等[17]研究表明，在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中特異性敲低TBX2的表達，可使大部分細胞在G1期積累，從而抑制視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖。本研究結(jié)果顯示TBX2 inhibitor組細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的OD值均顯著低于CK組、NC組，提示下調(diào)TBX2表達能夠抑制腦膠質(zhì)瘤細胞增殖。腫瘤細胞的侵襲與遷移是腦膠質(zhì)瘤疾病進展的關(guān)鍵，腫瘤的侵襲與遷移是一個涉及多個因子參與、多個步驟的復雜過程，包括腫瘤細胞的分離、運動、侵入其他組織及胞外基質(zhì)的降解[18]。E-cadherin是促進細胞移動、癌細胞浸潤的一種蛋白。房前等[19]研究表明TBX2通過直接調(diào)控靶基因E-cadherin，提高癌細胞的侵襲與遷移能力。本研究結(jié)果顯示TBX2 inhibitor組細胞遷移數(shù)目顯著低于CK組、NC組，TBX2 inhibitor組細胞侵襲數(shù)目顯著低于CK組、NC組，提示下調(diào)TBX2表達可顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲與遷移。

綜上所述，TBX2在腦膠質(zhì)瘤細胞中表達上調(diào)，下調(diào)TBX2表達可抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移與侵襲，有望作為潛在靶標應(yīng)用于靶向治療。然而本研究僅初步探究了TBX2在膠質(zhì)瘤中的表達及其對膠質(zhì)瘤細胞U251生物行為學的影響，其中涉及的具體分子機制將進一步深入研究。