李妍儀 申英 張秀艷

子宮腺肌病(adenomyosis，AM)為育齡期女性常見(jiàn)卻難治的一種良性疾病，其定義為子宮內(nèi)膜的腺體及間質(zhì)侵入子宮肌層形成的病變，現(xiàn)已作為異常子宮出血FIGO分期(PALM-COEIN)中的一種獨(dú)立因素[1]。子宮腺肌病雖然是一種良性疾病，卻表現(xiàn)出一些類(lèi)似惡性腫瘤的生物學(xué)行為，如異位病灶異常增殖、浸潤(rùn)、甚至向鄰近組織侵襲等[2]。關(guān)于有活性的異位子宮內(nèi)膜來(lái)源的學(xué)說(shuō)有多種，如種植學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)、誘導(dǎo)學(xué)說(shuō)、在位內(nèi)膜決定論等。子宮腺肌病患者的主要臨床表現(xiàn)是月經(jīng)改變(常見(jiàn)經(jīng)量增多、經(jīng)期延長(zhǎng))和痛經(jīng)進(jìn)行性加重。進(jìn)行性加重的痛經(jīng)對(duì)子宮腺肌病患者的生活質(zhì)量和心理健康造成了極其嚴(yán)重的影響。該病具有形態(tài)多、范圍廣、極具復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，致使其難以被早期診斷，越來(lái)越多的患者因不堪疾病反復(fù)發(fā)作的痛苦而選擇全子宮切除術(shù)這種徹底性的治療手段，對(duì)患者生育功能及生活質(zhì)量造成了極大損害。然而目前子宮腺肌病的病因及發(fā)病機(jī)制以及痛經(jīng)的發(fā)生機(jī)制卻尚未完全明確。鈣周期蛋白S100A6很可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞分化、影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方式，改變細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡能力，來(lái)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。據(jù)此推測(cè)S100A6也可能通過(guò)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[3]，參與子宮腺肌病和(或)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究S100A6在子宮腺肌病患者子宮相關(guān)組織中的表達(dá)水平，探索其在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及與患者痛經(jīng)的關(guān)系，以期證明可以通過(guò)子宮內(nèi)膜活檢等方法術(shù)前獲取患者子宮內(nèi)膜，檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中S100A6的表達(dá)，為術(shù)前診斷子宮腺肌病提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年8月在河北省承德市中心醫(yī)院婦科就診，行全子宮切除術(shù)，臨床病例資料完整的子宮腺肌病患者30例作為病例組；選取同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的患者30例作為對(duì)照組。術(shù)前通過(guò)模擬視覺(jué)評(píng)分法(visual analogue score,VAS)對(duì)病例組子宮腺肌病患者進(jìn)行痛經(jīng)程度評(píng)分，輕度痛經(jīng)10例中度痛經(jīng)12例，重度痛經(jīng)8例。2組患者年齡、BMI、孕次、產(chǎn)次、經(jīng)期、月經(jīng)周期相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組臨床特點(diǎn)比較

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 所有病例的診斷經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)，2組患者均未絕經(jīng)、未放置宮內(nèi)節(jié)育器及術(shù)前6個(gè)月內(nèi)均未使用過(guò)激素類(lèi)藥物。子宮腺肌病患者，且不同時(shí)患有子宮內(nèi)膜異位癥。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.3 免疫組化法檢測(cè)S100A6 分別選取病例組包埋在位子宮內(nèi)膜組織、子宮肌層異位內(nèi)膜組織蠟塊和對(duì)照組包埋正常子宮內(nèi)膜組織蠟塊。全部石蠟標(biāo)本入選后進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片，置于玻片，60℃烤片過(guò)夜，常規(guī)脫蠟水化，蒸餾水水洗2次,檸檬酸高溫高壓修復(fù)2 min，PBS洗5 min×3次。3%雙氧水處理10 min，PBS洗5 min×3次，每張切片依次滴加S100一抗4℃冰箱過(guò)夜，PBS洗5 min×3次，二抗孵育20 min，PBS洗5 min×3次，DAB進(jìn)行顯色10 min，蘇木紫復(fù)染，最后常規(guī)脫水透明，進(jìn)行封片。在高倍鏡下對(duì)圖像進(jìn)行觀察分析。實(shí)驗(yàn)相應(yīng)的試劑：免疫組織化學(xué)染色Rabbit Anti-S100A6 antibody，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 結(jié)果判讀 結(jié)果判定在雙盲下進(jìn)行，由至少2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師分別閱片和統(tǒng)計(jì)結(jié)果。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞漿和(或)胞膜、胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒標(biāo)記為陽(yáng)性。陽(yáng)性判斷：在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察，然后在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)染色細(xì)胞率計(jì)分：0～5%評(píng)0分；6%～40%評(píng)1分；41%～70%評(píng)2分；>70%評(píng)3分。(2)染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。每張切片免疫組化染色評(píng)分(IRS)=染色細(xì)胞率分?jǐn)?shù)+染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)。IRS分?jǐn)?shù)<1分為陰性(-)，分?jǐn)?shù)≥1分為陽(yáng)性。陽(yáng)性強(qiáng)度根據(jù)所得分值分為3個(gè)等級(jí)：1～2分記為弱陽(yáng)性(+)；3～4分記為中度陽(yáng)性(++)；5～6分記為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

2 結(jié)果

2.1 3組A100A6免疫組化染色 病例組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)中均可檢測(cè)到S100A6的表達(dá)，其主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜的上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜(呈淡黃色、棕黃色或棕褐色)。圖1可見(jiàn)子宮內(nèi)膜腺體組織異位至子宮肌層組織中，稱(chēng)之為異位內(nèi)膜。S100A6在對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜組織中無(wú)表達(dá)。見(jiàn)圖1～3。

2.2 3組S100A6表達(dá)及其陽(yáng)性率比較 病例組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜S100A6的表達(dá)陽(yáng)性率分別為80%和70%，對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜的S100A6表達(dá)陽(yáng)性率為33.33%。見(jiàn)表2。

2.3 3組S100A6表達(dá)水平比較

2.3.1 病例組在位子宮內(nèi)膜與對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜S100A6表達(dá):病例組在位子宮內(nèi)膜S100A6表達(dá)水平高于對(duì)照組(Z=-3.745，P=0.00018)。見(jiàn)表3。

2.3.2 病例組異位子宮內(nèi)膜與對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜S100A6表達(dá):病例組異位內(nèi)膜的S100A6表達(dá)水平高于對(duì)照組(Z=-3.215，P=0.001)。見(jiàn)表3。

圖1 病例組異位內(nèi)膜組織中S100A6的表達(dá)(免疫組化×400)圖2 病例組在位子宮內(nèi)膜組織中S100A6的表達(dá)(免疫組化×400)圖3 對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜組織中S100A6的表達(dá)(免疫組化×400)

表2 S100A6在子宮腺肌病組和對(duì)照組中的表達(dá) n=30，例

表3 3組S100A6 的表達(dá)水平 n=30，例

2.3.3 病例組在位子宮內(nèi)膜與病例組異位子宮內(nèi)膜S100A6表達(dá):病例組在位內(nèi)膜S100A6的表達(dá)水平與病例組異位內(nèi)膜相似(Z=-1.134，P=0.257)。

2.4 S100A6在子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)強(qiáng)度與痛經(jīng)程度比較 不同痛經(jīng)程度的患者在位子宮內(nèi)膜組織中S100A6表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 S100A6在子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)強(qiáng)度與痛經(jīng)程度比較 例

3 討論

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，子宮腺肌病患者的痛經(jīng)率高達(dá)64.8%～77.8%[4]，近年來(lái)其發(fā)病率顯著提高，但迄今為止，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。目前子宮腺肌病的主要治療方法包括(1)藥物治療如：應(yīng)用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)、無(wú)相對(duì)禁忌證的女性應(yīng)用左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)(LNG-IUS)以及口服抗雌激素藥物等；(2)介入治療如：子宮動(dòng)脈栓塞、高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)等[5]；(3)手術(shù)治療：開(kāi)腹或腹腔鏡子宮切除術(shù)、子宮肌層異位病灶切除術(shù)等。因藥物治療時(shí)，患者不良反應(yīng)多，停藥后癥狀易復(fù)發(fā)，大多數(shù)患者因無(wú)法忍受進(jìn)行性加重的痛經(jīng)而最終選擇全子宮切除術(shù)這種極端的治療手段。如今子宮腺肌病患者群體趨于年輕化，選擇子宮切除術(shù)無(wú)法保留其生育功能，保守治療復(fù)發(fā)率高，臨床醫(yī)生在選擇治療方案時(shí)進(jìn)退兩難，越來(lái)越多的臨床醫(yī)生及患者亟待新的治療方法出現(xiàn)?，F(xiàn)子宮腺肌病痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，仍在不斷探討的過(guò)程中，可能是由EMJZ區(qū)的功能失調(diào)、神經(jīng)源性因素、異常的激素水平、炎性反應(yīng)等多種因素共同介導(dǎo)。許多神經(jīng)遞質(zhì)(細(xì)胞因子、肽類(lèi)激素等)及相應(yīng)受體的表達(dá)可鏈接神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，參與這幾大系統(tǒng)之間的信息交流，使其互相影響，共同發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致AM患者產(chǎn)生痛經(jīng)等臨床癥狀。其中最被廣泛接受及認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制是子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)功能失調(diào)。子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)(endometrial-myometrial iunctional zone，EMJZ)是子宮內(nèi)膜基底層和子宮肌層(IM)之間的區(qū)域。由組織損傷等因素導(dǎo)致EMJZ結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增加了該部位的張力，進(jìn)而促進(jìn)了雌激素分泌，分泌過(guò)多的雌激素可上調(diào)子宮肌層細(xì)胞上催產(chǎn)素受體的表達(dá)，其作用是誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的過(guò)度運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致更多EMJZ區(qū)組織的損傷，使基底層子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)組織進(jìn)一步向子宮肌層的深處移位，形成子宮腺肌病的病灶，引發(fā)痛經(jīng)[6]。神經(jīng)生長(zhǎng)也是引起疼痛的直接原因，考慮為有髓神經(jīng)纖維與無(wú)髓神經(jīng)C纖維發(fā)揮重要作用[7]，而S100則是高度特異性表達(dá)于此類(lèi)神經(jīng)纖維的標(biāo)記物[8]，同時(shí)也是子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌病常用的神經(jīng)標(biāo)記物[9,10]。

本課題針對(duì)S100A6在AM患者相關(guān)組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究。S100A6蛋白即鈣周期蛋白，是S100蛋白家族的成員之一，S100A6蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為10 235，像其他S100蛋白家族成員一樣，其活性形式為同源二聚體。S100A6蛋白與鈣離子結(jié)合后，其EF手型經(jīng)典區(qū)得到暴露，進(jìn)而可以與多種靶蛋白結(jié)合(原肌球蛋白、膜聯(lián)蛋白Ⅱ、Ⅵ、Ⅺ、鈣調(diào)結(jié)合蛋白等)[11]。S100A6蛋白最初由Kuznicki和Filipek在Ehrlich腹水瘤中檢出，主要存在于細(xì)胞的胞質(zhì)、胞膜及核被膜上(包括核膜內(nèi)表面)[12]。近年研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2條有關(guān)S100A6在細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮作用的信號(hào)通路：一是S100A6可能通過(guò)RAGE(晚期糖基化終末產(chǎn)物受體)信號(hào)通路發(fā)生作用[13]，RAGE作為一種細(xì)胞膜表面受體，通過(guò)第2個(gè)C型S100A6主要與RAGE的第 2個(gè) C型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域與S100A6蛋白結(jié)合并發(fā)揮細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)作用。其機(jī)制可能是通過(guò)激活ROS依賴(lài)性的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminalkinase,JNK)及凋亡蛋白酶3和7來(lái)引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而激活下游的NF-kB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的一些促進(jìn)生存和(或)抗凋亡通路；二是發(fā)現(xiàn)S100A6通過(guò)結(jié)合CacyBP/SIP蛋白，阻斷β-catenin磷酸化，使β-catenin增多。而后者是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，Wnt與跨膜Frlzzled家族受體的N末端細(xì)胞富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和輔受體脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)5/6結(jié)合時(shí)，使得Dishevelled蛋白活化，將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，抑制破壞復(fù)合物Axin，腺瘤病大腸桿菌(APC)，蛋白磷酸酶2A(PP2A)，糖原合成酶激酶3(GSK3)和酪蛋白激酶1α(CK1α)的活性，使得β-catenin磷酸化被阻斷，大量去磷酸化β-catenin轉(zhuǎn)移入核，并且這種信號(hào)與核因子轉(zhuǎn)錄因子/淋巴樣增強(qiáng)因子(TCF/LEF)相互結(jié)合，能進(jìn)一步激活靶基因，從而能誘導(dǎo)疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。結(jié)合近年來(lái)有關(guān)AM發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)研究分析，認(rèn)為S100A6很可能參與子宮腺肌病的發(fā)生。利用反義核酸技術(shù)阻斷S100A6的表達(dá)，是否可以抑制子宮腺肌病的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[15]，有待進(jìn)一步研究。

劉澤群等[16]研究發(fā)現(xiàn)：S100A6在子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中存在高表達(dá)，并推斷其可能參與子宮腺肌病的發(fā)生，且在子宮腺肌病患者疼痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，其通過(guò)影響細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡能力，造成子宮腺肌病異位內(nèi)膜的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。車(chē)璇等[8]通過(guò)檢測(cè)子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)S100蛋白及蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)的表達(dá)，并探究其與子宮腺肌病發(fā)病機(jī)制及患者痛經(jīng)的關(guān)系，結(jié)論是：子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)S100蛋白與PGP9.5的表達(dá)異常增高，這可能參與子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制，并可能在子宮腺肌病患者疼痛的發(fā)生中起重要作用。Tokushige等[7]發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)重痛經(jīng)和性交困難的子宮內(nèi)膜異位癥患者直腸陰道子宮內(nèi)膜異位病灶中出現(xiàn)了由非特性抗體 S100 蛋白染色的神經(jīng)纖維[7]。但對(duì)于同時(shí)檢測(cè)子宮腺肌病患者在位子宮內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中S100A6的表達(dá)情況的相關(guān)研究比較少見(jiàn)。本研究通過(guò)檢測(cè)S100A6在病例組子宮腺肌病患者在位子宮內(nèi)膜、異位內(nèi)膜和對(duì)照組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：病例組在位子宮內(nèi)膜和異位到肌層的子宮內(nèi)膜組織中S100A6的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。子宮腺肌病患者相關(guān)組織中表達(dá)異常增高的S100A6與患者痛經(jīng)程度存在正相關(guān)，可由此推斷，S100A6可作為子宮腺肌病的一種診斷參考指標(biāo)。同時(shí)，本研究通過(guò)檢測(cè)同一位子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位到肌層的子宮內(nèi)膜組織中S100A6的表達(dá)情況，得出結(jié)論：病例組在位內(nèi)膜S100A6的表達(dá)水平與病例組異位內(nèi)膜相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故推測(cè)可以通過(guò)術(shù)前子宮內(nèi)膜活檢等方法獲取患者子宮內(nèi)膜組織，通過(guò)病理免疫組化法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織中S100A6的表達(dá)，作為診斷子宮腺肌病的重要參考指標(biāo)，亦可根據(jù)其表達(dá)程度評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度。

李蘊(yùn)薇等[17]研究結(jié)果顯示221例子宮腺肌病患者中72.4%血清CA125水平升高，痛經(jīng)癥狀及其嚴(yán)重程度與血清CA125水平升高有關(guān)。給予GnRH-a后血清CA125水平能明顯下降。CA125是目前研究比較透徹，亦最常用于子宮內(nèi)膜異位癥診斷的一種糖蛋白、其檢測(cè)敏感性與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。但單獨(dú)檢測(cè)CA125表達(dá)水平，其診斷特異性較低，因此目前國(guó)內(nèi)外大量研究推薦聯(lián)合其他指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。張清等[18]的研究結(jié)果提示CA125聯(lián)合CA199可將診斷敏感度提高到60%。Agic等[19]發(fā)現(xiàn)CA125聯(lián)合檢測(cè)CCR1mRNA(趨化因子受體-1信使RNA)和MCP1(單核細(xì)胞趨化蛋白-1)的表達(dá)水平，可以使診斷敏感性達(dá)到92.2%，特異性達(dá)到81.6%。Acimovic等[20]近年研究發(fā)現(xiàn)CA125聯(lián)合檢測(cè)生存素(survivin)和VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)，其敏感性可達(dá)到到93.3%，特異性可達(dá)到90%。但因本研究時(shí)間及經(jīng)費(fèi)有限，樣本量較小，只通過(guò)病理免疫組化檢測(cè)了S100A6這一種子宮腺肌病患者組織中的觀測(cè)指標(biāo)。在之后的研究中可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加血清學(xué)觀測(cè)指標(biāo)(如CA125)，探究其與子宮內(nèi)膜組織中S100A6聯(lián)合檢測(cè)子宮腺肌病，是否能提高診斷敏感性及特異性。

目前，子宮腺肌病難以用微創(chuàng)甚至無(wú)創(chuàng)的方法，診斷和評(píng)估病情嚴(yán)重程度[21]，影像學(xué)診斷為現(xiàn)今診斷子宮腺肌病的主要方法，特異性診斷子宮腺肌病的分子標(biāo)志物尚未出現(xiàn)。本研究顯示，病例組在位內(nèi)膜與子宮肌層異位內(nèi)膜S100A6的表達(dá)水平相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且兩者的S100A6的表達(dá)水平均高于對(duì)照組。因此推斷，可以通過(guò)子宮內(nèi)膜活檢的方法，取得子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)S100A6的表達(dá)水平,將其作為診斷子宮腺肌病的一項(xiàng)重要參考指標(biāo)。還可在子宮腺肌病患者保守治療前后取患者子宮內(nèi)膜，進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)S100A6的表達(dá)水平，作為評(píng)價(jià)保守治療療效，甚至預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的一項(xiàng)指標(biāo)。以后可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì)上述內(nèi)容進(jìn)一步研究。