柴鷗 侯志敏

唐氏綜合征(Down’s syndrome,DS)又稱21三體綜合征，是臨床上常見的因常染色體數(shù)目異常引起的遺傳性疾病，在新生兒中發(fā)病率為1/800～1/600[1]。由于多余的染色體物質(zhì)打破了遺傳平衡，導(dǎo)致胎兒在母體內(nèi)發(fā)育異常，新生兒表現(xiàn)為智力障礙，精神體格發(fā)育遲緩，并伴有嚴(yán)重多組織、器官發(fā)育畸形[1,2]。目前針對(duì)DS尚無(wú)有效的治療方法，因此有效的產(chǎn)前診斷和預(yù)防措施可減少此類患兒的出生。羊膜穿刺是臨床上進(jìn)行DS診斷的主要方法，但由于該種方法會(huì)有1%～2%流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[3]，因而基于羊膜穿刺的產(chǎn)前診斷很難普及[4]。因而，孕中期檢測(cè)母體血清標(biāo)志物進(jìn)行DS無(wú)創(chuàng)性篩查，判斷發(fā)生DS的風(fēng)險(xiǎn)，已成為目前產(chǎn)前篩查的主要方法。James等[5]研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)葉酸代謝的亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)可能在染色體分離過(guò)程中起重要作用，再采用病例對(duì)照的方法研究發(fā)現(xiàn)MTHFR 基因多態(tài)性是DS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。近年來(lái)隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)母親葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性可能是DS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素，但由于種族和地域的差異，這類研究結(jié)果還存在爭(zhēng)議[6]。本研究以中國(guó)人群為研究對(duì)象，選取葉酸代謝相關(guān)基因MTHFR的兩個(gè)位點(diǎn)，通過(guò)分析其在孕中期母親中的分布頻率及DS風(fēng)險(xiǎn)性，探索葉酸代謝基因的多態(tài)性與DS風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年6月于我院婦產(chǎn)科門診建卡的孕中期(14～21周)女性150例，年齡20～38歲，行DS產(chǎn)前篩查，以DS風(fēng)險(xiǎn)率1/270為切割值，≥1/270者為高危組(50例)，<1/270者為低危組(100例)受試者排除其他妊娠期疾病。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，產(chǎn)婦簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清標(biāo)志物檢測(cè)：采集受試孕婦清晨空腹外周血5 ml，標(biāo)本3 000 r/min 離心10 min后分離血清，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清標(biāo)志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)，人類絨毛膜促性腺激素β亞單位(β-human chorionicgonadotrophin,β-hCG)和游離雌三醇(unconjugated oestriol,uE3)，采用軟件綜合分析DS風(fēng)險(xiǎn)率(切割值：1/270)。

1.2.2 DNA抽提：同時(shí)收集EDTA抗凝血3～5 ml用于MTHFR C677T和A1298C基因多態(tài)性的檢測(cè)，采用QIAamp DNA Blood kit試劑盒提取基因組DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序：MTHFR基因擴(kuò)增采用 Applied BiosystemsTM的VeritiTMPCR 熱循環(huán)儀(Thermo Fisher scientific公司)。引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件同文獻(xiàn)[6]，具體如下：根據(jù)GenBank中MTHFR基因序列號(hào)(ID:4524)采用NCBI的Blast在線引物設(shè)計(jì)軟件合成引物：MTHFER C677T 上游引物：5’-ACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTA-3’，下游引物： 5’-TCGGTGCATGCCTTCACAA-3’；A1298C 上游引物：5’-GGTCCCCACTTCCAGCATC-3’，下游引物：5’-GCAAGTC-CCCCAAGGAGG-3’。反應(yīng)總體系20 μl,其中PCR mix(日本東洋紡)10 μl，上、下游引物各1 μl(10 μmol/L)，DNA模板1 μl，雙蒸水7 μl。PCR產(chǎn)物直接送Invitrogen生物公司進(jìn)行單向或雙相測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 DS血清標(biāo)志物情況 高危組AFP和uE3含量低于低危組(P<0.001)；高危組β-HCG含量顯著高于低危組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

組別AFP(μg/L)β-hCG(μg/L)uE3(mg/ml)高危組(n=50)20.53±2.9960.13±5.970.78±0.16低危組(n=100)29.99±3.19*10.88±3.37*1.54±0.15*

注：與高危組比較，*P<0.05

2.2 H-W 遺傳平衡檢測(cè) 高危組與低危組的MTHFR C677T、A1298C 基因型分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律(P>0.05)，研究對(duì)象具有群體代表性。見表2。

表2 MTHFR基因Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢測(cè)

2.3 MTHFR C677T和A1298C基因頻率及等位基因頻率比較 根據(jù)唐氏篩查初步結(jié)果，將受檢查者分為高危組和低危組，其中高危組50例，低危組100例，C677T基因型比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而A1298C對(duì)應(yīng)的基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 MTHFR C677T和A1298C基因型及等位基因平率的比較

2.4 MTHFR單體型分析 雖然上述兩個(gè)位點(diǎn)的基因型未見明顯差異，但進(jìn)一步采用SHEsis在線軟件構(gòu)建單體型，高危組和低危組中攜帶的單體型存在差異，攜帶“C-A”單體型者其DS風(fēng)險(xiǎn)明顯降低[P<0.001,OR=0.325,95%CI (0.196～0.537)]，但攜帶“C-C”或“T-C”單體型者其明顯增加DS的風(fēng)險(xiǎn)，統(tǒng)計(jì)量分別為[P<0.001,OR=4.177,95%CI (2.157～8.091)]和[P<0.001,OR=4.207,95%CI (2.065～8.570)]是一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素。見表4。

表4 MTHFR個(gè)SNP位點(diǎn)單體型與DS風(fēng)險(xiǎn)分析

3 討論

唐氏綜合征又名先天愚型，是最早確認(rèn)的常染色體病，因其最初發(fā)現(xiàn)人體第21號(hào)染色體發(fā)生三體異常而致病，故又稱21-三體綜合征，是全球重點(diǎn)預(yù)防的重大缺陷疾病。

經(jīng)羊膜穿刺檢測(cè)胎兒細(xì)胞核型是診斷唐氏綜合征的金標(biāo)準(zhǔn)，但羊膜穿刺具有諸多的不良反應(yīng)，包括宮內(nèi)感染和流產(chǎn)，導(dǎo)致該技術(shù)無(wú)法廣泛開展。目前主要采用孕中期產(chǎn)婦血清學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行篩查，利用風(fēng)險(xiǎn)分析軟件計(jì)算患DS的風(fēng)險(xiǎn)率。本研究對(duì)高危組和低危組血清標(biāo)志物比較發(fā)現(xiàn)，高危組AFP和uE3均低于低危組，而β-HCG顯著高于低危組，這可能是DS胎兒發(fā)育遲緩，包括腎上腺、肝臟、胎盤等組織器官發(fā)育不全，合成AFP及uE3的能力降低，因而在母親體內(nèi)這兩種標(biāo)志物的濃度異常降低[8]。然而，上述篩查方法的預(yù)測(cè)率僅達(dá)65%～80%[9]，無(wú)法滿足人民日益增長(zhǎng)的健康要求。因此，需要更加精確和完善的預(yù)測(cè)方法。

研究表明，造成DS的主要原因是細(xì)胞的低21號(hào)染色體無(wú)法完全分離，進(jìn)一步有學(xué)者開始提出葉酸代謝異常是導(dǎo)致染色體分離異常的主要原因[2,10]，因?yàn)槿~酸代謝產(chǎn)生的亞甲基四氫葉酸可參與DNA的合成和DNA甲基化以維持DNA的穩(wěn)定性。而葉酸代謝有多個(gè)酶的參與，其中亞甲基四氫葉酸通過(guò)MTHFR與甲硫氨酸合成酶是其重要的關(guān)鍵酶。葉酸代謝酶基因的突變會(huì)導(dǎo)致這些關(guān)鍵酶催化質(zhì)量下降，DNA甲基化程度減低，DNA穩(wěn)定性降低而致染色體分離不全[6]。MTHFR C677T的突變已被大家廣泛認(rèn)識(shí)的突變位點(diǎn)，此種突變可使基因產(chǎn)物丙氨酸替換為纈氨酸，該突變體不耐熱而導(dǎo)致酶活性降低，進(jìn)而造成DNA低甲基化，參與三體的發(fā)生過(guò)程[11]。本研究結(jié)果顯示，高危組女性發(fā)生MTHFR、發(fā)生C677T C-T的突變發(fā)生率更高，說(shuō)明該位點(diǎn)突變可能與DS發(fā)生有關(guān)，與以往研究結(jié)果[12]一致。然而，有文獻(xiàn)報(bào)道稱日本人[13]、意大利人[14]MTHFR C677T 的多態(tài)性與DS 綜合癥不存在相關(guān)性，梁蓉等[15]報(bào)道北京地區(qū)MTHFR C667T 的多態(tài)性不是DS 母親的風(fēng)險(xiǎn)因素。

另一個(gè)MTHFR重要的突變位點(diǎn)為A1298C，其突變發(fā)生胞嘧啶取代腺嘌呤，導(dǎo)致編碼多肽由原來(lái)的谷氨酸變成丙氨酸，影響酶活性。對(duì)印度女性的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)A1298C位點(diǎn)突變不是DS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[12]，但在埃及女性中其又是一種重要的危險(xiǎn)因素[16]。本研究結(jié)果顯示，高危組中“C”等位基因頻率顯著高于低危組，提示改位點(diǎn)突變與DS風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。

由于地區(qū)和種族的不同，MTHFR C677T和A1298C兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)DS風(fēng)險(xiǎn)的影響不盡相同，但是確認(rèn)的是MTHFR C677T和A1298C多態(tài)性是可以直接影響DNA低甲基化[17]。因此，我們采用單體型構(gòu)建的方法同時(shí)分析這兩個(gè)位點(diǎn)與DS風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)“C-C”和“C-T”兩種單體型可DS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加4.177倍和4.207倍；而“C-A”單體型攜帶者發(fā)生DS的風(fēng)險(xiǎn)為0.325，故認(rèn)為該單體型為一個(gè)重要的保護(hù)因素。

綜上所述，由于地域和人種的差別，MTHFR C677T和A1298C位點(diǎn)基因及基因型是本研究對(duì)象的風(fēng)險(xiǎn)因素，但DS的發(fā)生又不僅僅同MTHFR基因多態(tài)性有關(guān)，可能還存在其他潛在因素影響DS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，如孕婦年齡[18]、環(huán)境因素[19]、營(yíng)養(yǎng)因素[20]等相關(guān)。因此，在評(píng)估DS風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)從遺傳和環(huán)境等多方面全面考慮，從而得出更確切的結(jié)論。