李俐漫，劉 潔，劉明君，劉松梅

(1.武漢大學中南醫(yī)院基因診斷中心，湖北 武漢 430071；2.鄂東醫(yī)療集團黃石市中醫(yī)醫(yī)院(黃石市傳染病醫(yī)院)檢驗科，湖北 黃石 435000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染在全球廣泛流行，是導致乙肝肝硬化和原發(fā)性肝癌發(fā)生的重要病因[1]。HBV-DNA為嗜肝雙鏈DNA病毒，分為短正鏈和長負鏈[2]，在其逆轉錄過程中，DNA聚合酶和逆轉錄酶校正功能缺乏，因此HBV-DNA有相對較高的突變率，易產生耐藥。HBV-DNA在長期的點突變過程中形成了A～J共10種基因型，在中國以B、C型為主[3，4]。拉米夫定(LVD)和阿德福韋酯(ADV)在臨床抗HBV治療中應用最為廣泛[5，6]，但研究發(fā)現(xiàn)如果長期使用，易導致HBV-DNA聚合酶基因變異，引發(fā)耐藥[7]。本文探討HBV感染患者耐藥與HBV基因型、肝功能、凝血功能和HBV-DNA拷貝數(shù)的關系，以及LVD不同耐藥突變位點之間上述臨床指標比較，為臨床用藥提供一定的參考數(shù)據(jù)和科學基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料2015年11月至2018年6月于武漢大學中南醫(yī)院就診，有明確HBV基因分型及耐藥基因型檢測結果的113例患者，均有LVD或ADV等核苷類藥物治療史。男79例，女34例，年齡20～76歲[(43.2±1.3)歲]。所有患者診斷均符合2015年版慢性乙型肝炎防治指南標準，其中慢性乙型肝炎72例、乙肝肝硬化30例、肝癌11例。同時排除其他肝臟疾病。

1.2 方法將113例乙型肝炎患者根據(jù)HBV耐藥基因型檢測結果分為耐藥組(47例)與敏感組(66例)。LVD耐藥突變基因型為rt180M/rt204V/rt204I/rt207I；ADV耐藥突變基因型為rt181V/rt236T。LVD野生基因型為rt180L/rt204V/rt207M/rt207V；ADV野生基因型為rt181A/rt236N。耐藥組定義為LVD或(和)ADV耐藥基因任一突變位點檢測為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗及Fisher 確切概率法。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HBV感染患者耐藥分布在113例HBV感染者中，敏感型患者66例(58.4%)，耐藥型患者從高至低依次為LVD 35例(31.0%)，ADV 9例(8.0%)，兩者混合耐藥3例(2.6%)。在LVD耐藥患者中以rt180M+rt204V/I突變?yōu)橹?60.5%)，rt204I和rt207I分別占36.8%和2.7%。ADV耐藥以rt236T突變?yōu)橹?75.0%)，rt181V和rt181V+rt236T分別占16.7%和8.3%。

2.2 耐藥與HBV基因型耐藥型與敏感型患者HBV基因型多為B型，分別為74.5%和71.2%。耐藥型感染患者中C型和混合型(B+C型)分別為19.1%和6.4%，敏感型患者中C型和混合型分別為25.80%和3.0%。LVD和ADV耐藥患者的基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.259，P=0.533)。

2.3 HBV感染患者耐藥與DNA拷貝數(shù)耐藥組DNA拷貝數(shù)[(5.8±0.3)log copies/ml]與敏感組[(5.6±0.3)log copies/ml]比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.556)。LVD rt180M+rt204V/I突變組DNA拷貝數(shù)[(5.8±0.3)log copies/ml]與 rt204I突變組[(4.9±0.7)log copies/ml]比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.211)。

2.4 耐藥組與敏感組肝功能比較耐藥組患者血清天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)，總膽紅素(TIBL)，間接膽紅素(UBIL)，谷氨?；D移酶(GGT)水平均高于敏感組(P< 0.05)。兩組丙氨酸轉氨酶(ATL)，直接膽紅素(DBIL)，總蛋白(TP)，白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，見表1。

表1 耐藥組與敏感組肝功能比較

2.5 耐藥組與敏感組凝血功能比較耐藥組患者血清活化部分凝血活酶時間(APTT)水平高于敏感組，纖維蛋白原(FIB)水平低于敏感組(P< 0.05)。兩組凝血酶原時間(PT)，凝血酶原標準化比值(INR)，凝血酶原時間活動度(PTTA)和凝血酶時間(TT)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，見表2。

表2 耐藥組與敏感組凝血功能比較

2.6 LVD rt180M+rt204V/I突變與rt204I突變肝功能及凝血功能比較LVDrt180M+rt204V/I突變組血清TP和GLB水平均低于rt204I突變組(P< 0.05)，兩組凝血指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，見表3。

表3 LVD rt180M+rt204V/I突變與rt204I突變肝功能及凝血功能比較

3 討論

LVD是抗HBV藥物，在細胞內代謝產物為LVD三磷酸鹽。LVD三磷酸鹽為HBV-DNA聚合酶的作用底物和抑制劑，當其摻入HBV-DNA時，能在一定程度上抑制HBV復制，從而降低HBV-DNA濃度[8]。ADV是5’-單磷酸脫氧阿糖腺苷的無環(huán)類似物，進入細胞后被磷酸化，形成活性代謝產物ADV二磷酸鹽，可競爭性抑制HBV-DNA多聚酶活性并中止HBV-DNA鏈延長[9，10]。然而HBV-DNA具有高變異性的特質，致使HBV-DNA與核苷(酸)類似物型藥物結合力降低，藥物對病毒抑制作用隨之下降[11～13]。

本研究回顧性分析了47例耐藥型HBV感染患者的臨床指標，并用66例敏感型作為對照。結果發(fā)現(xiàn)在武漢地區(qū)耐藥組與敏感組患者均以B基因型為主，兩組在基因型構成比上無顯著性差異。然而，耐藥組患者血清AST、TIBL、UBIL、GGT水平明顯高于敏感組，說明當LVD或(和)ADV藥物起療效時，可以緩輕HBV感染患者的肝臟損害作用，與惠石生等[14]的研究結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，耐藥組的APTT明顯高于敏感組，F(xiàn)IB明顯低于敏感組。兩項凝血指標結果說明當HBV感染患者出現(xiàn)耐藥時，凝血功能也會受損。肝臟是多種凝血因子和纖溶因子產生的場所，凝血功能的改變與肝臟發(fā)生損傷常緊密關聯(lián)[15]，耐藥組患者凝血功能下降可能是由于肝臟功能損傷導致。然而，耐藥組與敏感組、LVDrt180M+rt204V/I突變組和rt204I突變組患者在DNA拷貝數(shù)無顯著性差異(P> 0.05)，LVD和ADV本為抗HBV-DNA藥物，能降低患者體內DNA拷貝數(shù)，該結果出現(xiàn)的原因可能是因為納入患者接受治療時DNA起始模板量和接受抗病毒治療的時間不能保證完全一致，并且納入患者的數(shù)量還有待進一步提高。但耐藥組DNA拷貝數(shù)的均值仍有高于敏感組的趨勢，DNA拷貝數(shù)升高的一類患者仍要充分重視是否產生了耐藥變異，此結果尚待進擴大數(shù)據(jù)后一步分析。

文獻報道，HBV對LVD耐藥性是DNA聚合酶突變誘發(fā)，LVD具有較高的耐藥率，治療5年后耐藥株出現(xiàn)的概率約為70%[5，16]，所以又將LVDrt180M+rt204V/I突變組和rt204I突變組各臨床指標進行比較，發(fā)現(xiàn)血清TP和GLB存在顯著性差異，說明臨床藥物對不同的耐藥突變位點的影響作用效果可能不同。

綜上所述，當HBV感染患者對LVD(或)和ADV產生耐藥時，其肝功能和凝血功能的損害相對于敏感組更加嚴重。這些臨床指標可作為早期預測耐藥發(fā)生與否的實驗室依據(jù)。雖然LVD具有較高的耐藥性，但是進一步的研究結果顯示ADV能有效的抑制對LVD、泛昔絡韋耐藥的DNA變異病毒株復制，替比夫定、ADV聯(lián)用與恩替卡韋單藥治療能減少耐藥發(fā)生，然而聯(lián)合用藥效果低于單藥治療效果[17]。結合本研究的結果提示在臨床用藥時需要根據(jù)患者個體情況采用個性化用藥，同時可考慮聯(lián)合用藥來降低耐藥株的產生，提高治療效果。