李秋華，周澤榮，祝曉麗，譚 穎，鐘小英，姜榮華，宋 革

(廣東省計劃生育科學技術(shù)研究所生殖中心，國家衛(wèi)生計生委男性生殖與遺傳重點實驗室，廣東 廣州 510600)

在多數(shù)育齡夫婦中，約15%的夫婦出現(xiàn)不孕不育?；诖耍绾斡行е委煵辉胁挥彩轻t(yī)學領(lǐng)域研究的熱點問題，而實施體外受精(in vitro fertilization，IVF)是臨床最常使用的治療方法之一。精子透明帶結(jié)合障礙是導致IVF受精率低的關(guān)鍵因素[1]，Meta文獻分析表明，其能力對受精結(jié)局有較高的預(yù)測價值[2]。大約13%的精液參數(shù)正常的男性出現(xiàn)透明帶結(jié)合障礙，而這一數(shù)值在少精癥與畸精癥男性中分別為56%和68%[3]?？衫猛该鲙ЫY(jié)合試驗明確是否發(fā)生透明帶結(jié)合障礙，但是由于人廢卵來源有限，限制了其在臨床上的應(yīng)用，確定精子透明帶結(jié)合能力和受精能力具有臨床意義[4]。本研究擬對精子細胞膜表面SLEX/透明帶(zona pellucida，ZP)結(jié)合蛋白展開定量研究，明確精子透明帶結(jié)合及其受精能力，為輔助生殖中診斷精子-透明帶結(jié)合缺陷的快速穩(wěn)定方法，更有利于闡述精子及其透明帶結(jié)合能力在輔助生殖中的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年1月至2018年12月本院生殖中心的就診者，年齡22～50歲，共76例精液標本(23例正常生育者，53例不育患者)。正常生育組納入標準：均為健康成年男性，已有生育史，其精液常規(guī)各項檢測指標正常(按照WHO第五版精液常規(guī)參數(shù))，精漿及血清抗精子抗體陰性。不育組納入標準：均為婚后1年以上不育(女方不孕因素已排除)，采用常規(guī)IVF治療過程中女方獲卵數(shù)大于5枚，受精率低于30%或者受精完全失敗患者的精液標本。無既往相關(guān)病史，生殖器及其附屬性腺體檢未見異常。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

1.2 方法

1.2.1試劑 精子細胞BWW培養(yǎng)液 (Toscience公司)；Percoll分離液(由美國的Pharmacia公司提供)；熒光標記SLEX-牛血清蛋白(Invitrogen)；一抗鼠抗人C1orf56，ZPBP1，SPACA1單克隆抗體(Abcam)；絡(luò)合異硫氰酸熒光素的豌豆凝集素(FITG-PSA)熒光標記試劑盒(生產(chǎn)廠家：安徽安科生物工程股份有限公司)。

1.2.2精子標本制備及分析與透明帶結(jié)合 所有供精人員需要禁欲時間控制為5～7天，通過手淫方法取精液于無菌塑料杯中，待其完全液化后，利用精子分析儀開展常規(guī)的檢查，包含精子濃度、形態(tài)等指標。采用半透明帶試驗(hemizona assay，HZA)分析不育組是否存在透明帶結(jié)合障礙，選取正常生育組男性的精子作為對照組。卵子來源于ICSI過程中未受精卵，之前患者簽署知情同意書。HZA結(jié)果用半透明帶精子結(jié)合試驗指數(shù)(HZI)表示，計算公式為不育組精子結(jié)合數(shù)/對照組精子結(jié)合數(shù)×100，HZI=30作為判斷是否存在結(jié)合障礙的臨界值，當HZI<30，認為存在障礙。

1.2.3精子自發(fā)頂體反應(yīng)率檢測 采用絡(luò)合異硫氰酸熒光素的豌豆凝集素(FITG-PSA)熒光標記法頂體染色。取優(yōu)化處理后的精子懸浮液5 μl涂片2張，自然干燥后以95%乙醇固定30 min。加入60～100 μl FITG-PSA工作液，4 ℃下反應(yīng)2～17 h；用純水沖片，1000倍油鏡下觀察，計數(shù)精子，并計算自發(fā)頂體反應(yīng)率=頂體反應(yīng)數(shù)/(頂體反應(yīng)數(shù)+AI)×100%，AI為頂體完整的精子。

1.2.4精子膜表面SLEX結(jié)合蛋白的測定 采用流式細胞儀檢測精子C1orf56，ZPBP1，SPACA1的免疫反應(yīng)性以及與熒光標記的 SLEX-牛血清蛋白(SLEX-BSA，一種新生糖蛋白)的結(jié)合能力。取透明帶結(jié)合障礙組精子加1 ml PBS洗滌并800 rpm離心收集細胞。按照抗體比例加入一抗，置于室溫孵育1～2小時，1500 rpm離心5 min，去上清，加入PBS重懸細胞，重復(fù)3次，置于0.1 ml PBS中。加入熒光二抗，室溫孵育1小時。500 rpm離心5 min，去上清，加入PBS重懸細胞，重復(fù)3次，最后置于0.2 ml PBS中，上機檢測。

1.2.5Western Blot 檢測精子膜蛋白中C1orf56，ZPBP1，SPACA1蛋白的表達水平 取透明帶結(jié)合障礙組精子加l ml 4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌并800 rpm離心收集細胞，加入細胞裂解液，充分作用后放置冰上；4 ℃條件下10分鐘13 000 rpm離心后可見分為兩相的溶液，蛋白膜位于兩相之間，去除上層相和下層相，保留中間蛋白沉淀，-80 ℃凍存。通過蛋白免疫印跡法(Western blot)對C1orf56、SPACA1等指標進行檢測。采用凝膠成像儀完成條帶掃描，根據(jù)其與內(nèi)參β-actin、GAPDH吸光度值之間的比值顯示相對含量數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不育組透明帶結(jié)合障礙的結(jié)果半透明帶試驗(HZA)中對照組采用23例正常生育的健康成年男性，不育組53例中采用常規(guī)IVF治療過程中受精率小于30%或者受精完全失敗患者的精液標本進行，分析不育組是否存在結(jié)合障礙，結(jié)果表明32例患者HZI<30，有60.4%的比例，認為出現(xiàn)透明帶結(jié)合障礙。

2.2 精子自發(fā)頂體反應(yīng)率檢測結(jié)果熒光標記法頂體染色中，不育組透明帶結(jié)合障礙患者的精子自發(fā)頂體反應(yīng)率(25.05±6.45)% 顯著高于對照組(5.12±2.12)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=14.244，P< 0.001)；在不育組中，透明帶結(jié)合障礙患者的精子自發(fā)頂體反應(yīng)率(25.05±6.45)% 明顯高于無透明帶結(jié)合障礙組(15.32±4.76)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.927，P< 0.001)。

2.3 精子膜表面SLEX結(jié)合蛋白的測定在精子膜表面SLEX結(jié)合蛋白中，不育組結(jié)合障礙患者的精子細胞中C1orf56、ZPBP1、SPACA1以及與熒光標記的 SLEX-牛血清蛋白的結(jié)合明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。見表1。

表1 兩組精子膜表面SLEX結(jié)合蛋白的測定比較

2.4 精子膜蛋白中各蛋白水平的表達精子膜蛋白中，不育組結(jié)合障礙患者的精子細胞中C1orf56、ZPBP及其SPACA1蛋白表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。見表2。

表2 精子膜蛋白中C1orf56、ZPBP1、SPACA1蛋白的表達水平比較

3 討論

在輔助生殖治療的過程中患者行常規(guī)IVF或者ICSI的選擇依據(jù)主要是精液常規(guī)分析結(jié)果，但精液常規(guī)分析不能提供關(guān)于精子功能如精子-透明帶結(jié)合能力的相關(guān)信息[5～7]。這些夫婦由于其男方精液常規(guī)分析結(jié)果正常，在第一次輔助生殖治療中，患者往往選擇常規(guī)IVF而非ICSI。在精子-透明帶結(jié)合異常的情況下存在受精率低甚至受精完全失敗的風險，給患者雙方帶來了經(jīng)濟上與情感上難以彌補的傷害[8]。

為了改善這一類患者的治療結(jié)局，希望利用可靠的檢測方法診斷出存在結(jié)合障礙的精子，能降低受精失敗的風險，改善臨床結(jié)局。受精的第一步始于獲能精子與透明帶的結(jié)合，然后與透明帶結(jié)合的精子發(fā)生頂體反應(yīng)[9]。精子與透明帶的結(jié)合始于精子膜表面的透明結(jié)合蛋白與透明帶蛋白分子上的糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生結(jié)合[10]。近20年來，對于透明帶糖蛋白上的多糖基分子研究較多，先前研究者采用超敏質(zhì)譜分析法，確定SLEX是人透明帶蛋白糖基上含量最多的糖鏈序列，同時還發(fā)現(xiàn)SLEX表位是精卵結(jié)合過程中透明帶蛋白分子上主要的多糖性配體[11]。

部分精液參數(shù)正常的男性存在透明帶結(jié)合障礙，進而導致不育[3]。本研究發(fā)現(xiàn)以23例正常生育的健康成年男性為對照組，對不育組采用常規(guī)IVF治療過程中受精率低或者受精完全失敗患者的精液標本進行HZA檢測，分析不育組是否存在透明帶結(jié)合障礙，結(jié)果表明32例患者HZI<30，有60.4%的比例，說明在IVF治療中，受精率低與結(jié)合障礙相關(guān)。有研究[14]表明隨 自 發(fā) 頂 體 反 應(yīng) 率 的 增 加，受 精 率 和優(yōu)胚率呈降低的趨勢。而造成這種后果的機制尚不明確。目前，對參與精子透明帶結(jié)合過程中的精子膜表面蛋白了解甚少，分子機制的尚不明確。在不育男性患者中，存在精子蛋白表達的異常[15]，但尚不明確其與透明帶結(jié)合障礙之間的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)在精子膜表面SLEX結(jié)合蛋白中，不育組透明帶結(jié)合障礙患者的精子細胞中C1orf56、ZPBP1、SPACA1以及與熒光標記的 SLEX-牛血清蛋白的結(jié)合比例均降低；在精子膜蛋白中，不育組透明帶結(jié)合障礙患者的精子細胞中C1orf56、ZPBP1、SPACA1蛋白表達水平均降低，推測，這些變化可能通過提高精子自發(fā)頂體反應(yīng)率來影響精子和透明帶結(jié)合。

綜上，本研究通過對精子表面SLEX/透明帶結(jié)合蛋白的定量分析，探索精子與透明帶結(jié)合機理。改善這一部分患者的臨床診斷與治療，在行輔助生殖治療前，采用可靠的檢測手段，精子自發(fā)頂體反應(yīng)率高和(或)SLEX/透明帶結(jié)合蛋白表達的降低對于預(yù)測受精情況有一定的價值對于提高輔助生殖技術(shù)的成功率有重要意義。