李 沛， 劉 宇

南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a.檢驗科； b.急診科， 湖南 衡陽 421001

肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率第三位的惡性腫瘤疾病[1]，發(fā)病率髙，預(yù)后差，病情進展快，易侵襲轉(zhuǎn)移，生存期短。據(jù)報道[2-3]，在全球每年新增肝癌病例中，約一半發(fā)生在我國，已成為威脅我國人群健康安全的主要原因。研究[4]表明，HBV感染是引發(fā)肝癌的重要因素，HBV攜帶者罹患肝癌的風(fēng)險極大提高，HBx蛋白作為HBV基因編碼的7個蛋白之一，可調(diào)節(jié)相關(guān)癌基因、抑癌基因表達，從而誘導(dǎo)肝癌發(fā)生[5]，HBx蛋白可通過下調(diào)miR-200a-3p表達而調(diào)控HBV感染患者肝癌細胞活力和細胞周期，進而促進其增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[6]。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類鏈相關(guān)基因A(MHC classⅠ chain-related gene A，MICA)是人類MHC基因Ⅰ類亞區(qū)的一種基因亞型[7]，MICA-A5.1是其第5外顯子的等位基因，可轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生可溶性MICA(soluble MICA，sMICA)分子，其與肝癌發(fā)生相關(guān)，sMICA水平高的肝硬化患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險最高[8]，有研究[9]表明，sMICA可促使人骨肉瘤的侵襲及免疫逃逸，抑制其表達，可恢復(fù)抗腫瘤免疫，并抑制腫瘤進展，但HBx基因?qū)epG2.2.15細胞MICA-A5.1表達及侵襲、遷移的影響目前尚不清楚，本研究通過體外培養(yǎng)HepG2.2.15細胞系實驗對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 人肝癌細胞HepG2.2.15(寧波明舟生物科技有限公司，貨號：MZ-1350)；HBx過表達質(zhì)粒、HBx空載質(zhì)粒、HBx siRNA、HBx siRNA陰性對照由上海吉瑪基因有限公司構(gòu)建合成；MEM培養(yǎng)基(武漢純度生物科技有限公司，貨號：CD-100044GM)；胎牛血清FBS、胰蛋白酶、青鏈霉素(美國Gibco公司，貨號分別為：10099-141、15050057、10378016)；sMICA 酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司，貨號：AE90082Hu)；兔源GAPDH、HBx、E-cadherin、MICA及Vimentin一抗、羊抗兔二抗(美國Abcam公司，貨號分別為：ab181602、ab39716、ab76319、ab62540、ab193555、ab150077)；伊紅染色液、蛋白裂解液、CKK-8試劑盒、BCA試劑盒(上海碧云天公司，貨號分別為：C0109、P0013K、C0037、P0011)。

1.2 主要儀器 Olympus CKX41顯微鏡(德國Leica公司)；Centrifuge 5424R低溫高速離心機(德國 Eppendorf 股份公司)；Model 680酶標儀、1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD轉(zhuǎn)膜儀、CFX96 Touch Deep Well熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(日本尼康公司)。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批通過(批號：LL201700008)。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)及分組處理 將購買的人肝癌細胞HepG2.2.15快速解凍復(fù)蘇，以完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的MEM培養(yǎng)基)重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至85%左右時，以胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)的細胞接種于24孔板中，隨機分為對照組、HBx過表達質(zhì)粒組、HBx空載質(zhì)粒組、HBx siRNA組、HBx siRNA陰性對照組，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，參照LipofectamineTM2000的說明書步驟，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及siRNA(質(zhì)粒及siRNA濃度參照各自說明書)分別以50 μl Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基溶解混勻，同時以50 μl Opti-MEM減血清培養(yǎng)基溶解混勻1 μl LipofectamineTM2000，均靜置20 min，將 LipofectamineTM2000溶液分別與質(zhì)粒及siRNA溶液合并后輕輕混勻，然后按組別分別處理細胞，以O(shè)pti-MEM減血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞6 h后，將其更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2 CKK-8實驗 取傳代培養(yǎng)的HepG2.2.15細胞以0.6×105個的細胞密度接種于96孔板中，按照1.4.1中的方法分組處理，分別在12 h、24 h、48 h后加入CKK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于全自動酶標儀中振蕩混勻后檢測450 nm波長下各孔吸光度(optical density，OD)，計算各組細胞活力，實驗重復(fù)3次。公式為：細胞活力(%)=實驗組 OD 值/對照組 OD 值 ×100%。

1.4.3 Transwell侵襲實驗 取傳代培養(yǎng)的HepG2.2.15細胞接種于24孔板中，按照1.4.1中的方法分組處理，于12 h后收集各組細胞，加入無血清的MEM培養(yǎng)基分別重懸后計數(shù)，將細胞液濃度調(diào)整為5×105個/ml，取200 μl加入基質(zhì)膠包被過的Transwell上室，在其下室加入含有10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出小室，以PBS漂洗細胞后，加入4%多聚甲醛于室溫下固定，然后以棉簽輕輕擦除基質(zhì)膠及上室內(nèi)細胞，加入500 μl 0.5%伊紅染液，于室溫下染色，最后用Olympus CKX41顯微鏡觀察穿膜細胞，并任選5個視野拍照，對其計數(shù)并記錄，以此作為評判細胞侵襲能力的指標。

1.4.4 細胞劃痕實驗 取傳代培養(yǎng)的HepG2.2.15細胞以5×105個/ml的密度接種于6孔板中，按照1.4.1中的方法分組處理，于12 h后以200 μl槍頭在六孔板中心劃一條直線(以無菌直尺作為標尺)，使用PBS將劃痕中的細胞漂洗干凈，然后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在Olympus CKX41顯微鏡下觀察遷移細胞數(shù)目，任選5個視野拍照，對其計數(shù)并記錄，以此作為評判細胞遷移能力的指標。

1.4.5 免疫印跡實驗 取傳代培養(yǎng)的HepG2.2.15細胞接種于24孔板中，按照1.4.1中的方法分組處理，于12 h后收集各組細胞，以蛋白裂解液及BCA試劑盒提取各組細胞總蛋白并測定其濃度，具體操作步驟參照說明書，制備SDS凝膠，各組取含相同質(zhì)量蛋白的樣品液進行電泳，然后濕轉(zhuǎn)將分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，以5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別經(jīng)兔源HBx、E-cadherin、Vimentin、MICA、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，羊抗兔二抗室溫孵育2 h后，最后以增強型化學(xué)發(fā)光法顯色，使用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，以Image Lab軟件對條帶進行分析。

2 結(jié)果

2.1 HBx基因?qū)毎盍Φ挠绊?與對照組比較，HBx過表達質(zhì)粒組細胞活力在24 h、48 h均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為8.268、12.680，P值均<0.001)；HBx siRNA組細胞活力在24 h、48 h均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為4.365、7.523，P值分別為0.036、<0.001)；為保證侵襲遷移實驗的準確性，避免HBx基因?qū)毎盍Φ挠绊?，故選擇藥物作用時間為12 h(表1)。

表1 HBx基因?qū)毎盍Φ挠绊?%)

注：1)與對照組比較，P<0.05。

2.2 各組細胞HBx、MICA-A5.1蛋白表達及細胞培養(yǎng)基中sMICA水平的檢測 與對照組比較，HBx過表達質(zhì)粒組細胞HBx及MICA蛋白表達水平、細胞培養(yǎng)基中sMICA水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為9.427、6.697、5.042，P值分別為<0.001、0.001、0.006)；HBx siRNA組細胞HBx及MICA蛋白表達水平、細胞培養(yǎng)基中sMICA水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為8.133、8.828、7.673，P值均<0.001)(圖1，表2)。

注：A，對照組；B，HBx空載質(zhì)粒組；C，HBx過表達質(zhì)粒組；D，HBx siRNA陰性對照組；E，HBx siRNA組。

表2 各組細胞HBx、MICA-A5.1蛋白相對表達水平及細胞培養(yǎng)基中sMICA水平

注：1)與對照組比較，P<0.05。

2.3 HBx基因?qū)毎w移的影響 與對照組比較，HBx過表達質(zhì)粒組遷移的細胞數(shù)目升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=22.740，P<0.001)；HBx siRNA組遷移的細胞數(shù)目降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=5.391，P=0.007)(圖2，表3)。

注：a，對照組；b，HBx空載質(zhì)粒組；c，HBx過表達質(zhì)粒組；d，HBx siRNA陰性對照組；e，HBxsiRNA組。

圖2HBx基因?qū)毎w移的影響

表3 HBx基因?qū)毎w移的影響

注：1)與對照組比較，P<0.05。

2.4 HBx基因?qū)毎忠u的影響 與對照組比較，HBx過表達質(zhì)粒組侵出Transwell小室的細胞數(shù)目升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=15.720，P<0.001)；HBx siRNA組侵出Transwell小室的細胞數(shù)目降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=7.694，P<0.001)(圖3，表4)。

2.5 HBx基因?qū)毎掀らg質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志蛋白E-cadherin、Vimentin的影響 與對照組比較，HBx過表達質(zhì)粒組細胞E-cadherin表達降低，Vimentin表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為5.258、10.500，P值分別為0.008、<0.001)；HBx siRNA組細胞E-cadherin表達升高，Vimentin表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為6.226、7.616，P值分別為0.002、<0.001)(圖4，表5)。

注：a，對照組；b，HBx空載質(zhì)粒組；c，HBx過表達質(zhì)粒組；d，HBx siRNA陰性對照組；e，HBxsiRNA組。

圖3HBx基因?qū)毎忠u的影響

表4 各組侵出Transwell小室的細胞數(shù)目比較

注：1)與對照組比較，P<0.05。

注：A，對照組；B，HBx空載質(zhì)粒組；C，HBx過表達質(zhì)粒組；D，HBx siRNA陰性對照組；E，HBx siRNA組。

圖4EMT標志蛋白E-cadherin、Vimentin的免疫印跡檢測結(jié)果

表5 各組細胞EMT標志蛋白E-cadherin、Vimentin的相對表達水平

注：1)與對照組比較，P<0.05。

3 討論

肝癌的治療以手術(shù)后放化療為主，但因早期腫瘤的轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)，其治療效果不能令人滿意，提高對肝癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移分子機制的理解對于肝癌的臨床治療具有重要意義。肝癌的發(fā)生機制復(fù)雜，是病毒感染、飲食習(xí)慣、遺傳等多因素長期相互作用的綜合結(jié)果[10-12]，其中，HBV感染是肝癌的主要致病因素[13]，合并HBV感染的肝癌患者病情進展快、生存期極短[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞Huh-7感染HBV后，HBV基因編碼的HBx蛋白在Huh-7細胞中表達，且其遷移侵襲能力增強，IFNα可通過促進其表達抗病毒蛋白而減少細胞遷移及侵襲，進而減輕HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生發(fā)展。因而，HBx基因可能調(diào)控HBV感染的HepG2細胞HepG2.2.15的侵襲、遷移。本研究以插入HBV全基因組并持續(xù)表達的HepG2細胞系HepG2.2.15作為研究對象，探討HBx基因?qū)epG2.2.15細胞侵襲、遷移的影響，以CKK-8檢測HBx基因?qū)epG2.2.15細胞活力的影響，結(jié)果顯示，過表達HBx基因可提升細胞活力，下調(diào)HBx基因可降低細胞活力，在HBx siRNA處理HepG2.2.15細胞24 h后其細胞活力約為59.36%，為保證侵襲遷移實驗的準確性，避免HBx siRNA對細胞活力的影響，故本研究選擇藥物作用時間為12 h進行后續(xù)實驗。研究結(jié)果表明，EMT是癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，向機體別處侵襲的關(guān)鍵病理過程[16]，期間細胞極性逐漸消失，上皮細胞表型逐漸轉(zhuǎn)化為具有較高遷移與侵襲能力的間質(zhì)細胞表型，同時上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達降低，間質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin表達升高[17]。本研究以HBx過表達質(zhì)粒上調(diào)HBx基因可使細胞Vimentin蛋白表達、遷移細胞數(shù)目、侵出Transwell小室的細胞數(shù)目升高，E-cadherin表達降低；以HBx siRNA下調(diào)HBx基因可使細胞Vimentin蛋白表達、遷移細胞數(shù)目、侵出Transwell小室的細胞數(shù)目降低，E-cadherin表達升高，表明HBx基因可介導(dǎo)HepG2.2.15細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，抑制其表達，能夠降低HBV感染的HepG2.2.15細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，進一步證實了HBV基因能夠促進肝癌細胞遷移侵襲及癌癥進展。

MICA基因含有6個外顯子，MICA-A5.1作為其第5外顯子等位基因，可使蛋白質(zhì)翻譯提前結(jié)束，從而相比其他外顯子更易形成sMICA分子，當(dāng)其被腫瘤、病毒或細菌等刺激時，可表達上調(diào)，產(chǎn)生更多的sMICA分子。研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，MICA基因型及sMICA水平與慢性丙型肝炎相關(guān)肝細胞癌的發(fā)生顯著相關(guān)，降低sMICA水平對治療索拉非尼耐藥的肝細胞癌有效。此外，sMICA水平在胰腺癌組織中的表達水平異常且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判斷胰腺癌預(yù)后的重要生物標志物[20]，因此，MICA-A5.1基因是調(diào)控HepG2.2.15細胞侵襲轉(zhuǎn)移的潛在作用靶點，但HBV基因是否可調(diào)控其表達，進而影響HepG2.2.15細胞侵襲的轉(zhuǎn)移，目前還未見研究。本研究對此進行了探討，結(jié)果顯示，上調(diào)HBx基因可升高HepG2.2.15細胞HBx、MICA蛋白表達水平及細胞培養(yǎng)基中sMICA水平，促使HBV感染的HepG2.2.15細胞侵襲轉(zhuǎn)移；下調(diào)HBx基因可降低細胞HBx、MICA蛋白表達水平及細胞培養(yǎng)基中sMICA水平，抑制HepG2.2.15細胞侵襲轉(zhuǎn)移，表明HBx基因可上調(diào)HepG2.2.15細胞中MICA-A5.1基因表達，進而促進其侵襲轉(zhuǎn)移，揭示了HBx基因促進HBV感染的HepG2.2.15細胞的侵襲遷移的作用機制可能是下調(diào)MICA-A5.1基因。

總之，HBx基因可調(diào)控HBV感染的HepG2.2.15細胞中MICA-A5.1基因表達，介導(dǎo)細胞侵襲轉(zhuǎn)移，上調(diào)該基因可促進HepG2.2.15細胞表達MICA-A5.1基因，進而增強其侵襲轉(zhuǎn)移能力，表明調(diào)控MICA-A5.1基因表達可能是HBx基因介導(dǎo)HBV感染的HepG2.2.15細胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制之一。但本研究只是進行了初步研究，未通過上調(diào)及下調(diào)MICA-A5.1基因進行對照驗證，也未涉及HBx調(diào)控MICA基因的具體分子機制，需要后續(xù)進一步深入研究。