陸 健，張佳佳，王佩佩，周國勤，慶 輝

(南京市水產科學研究所，南京 210036)

溫度作為一個重要的環(huán)境因子，在生物的生長、發(fā)育、形態(tài)、行為、數量和分布等方面起著極其重要的作用[1]。魚類作為變溫動物，其生長發(fā)育等所有的生理過程皆會受到環(huán)境因素的影響。先前的研究表明，在一定的適應范圍內，較高的溫度能促進魚苗的生長，從而帶來良好的經濟效益[2,3]。但如果水溫在短時間內急劇波動，魚類會因不能立即適應新的環(huán)境而導致死亡，同時魚類體中的蛋白質、酶等物質在高溫下會變性失活，造成魚體抵抗力變弱而死亡[4]。近年來，由于人類過渡的破壞，包括森林砍伐、耕地活動和工業(yè)生產導致內陸環(huán)境溫度總體升高，從而導致全球氣候的變化、極端天氣的頻現。生產活動中，由夏季連續(xù)高溫、極端天氣等事件引起的魚類致死事件已有報道[5,6]，因此探究急性高溫下魚類生理變化機制對于魚類的健康養(yǎng)殖具有重要的實踐指導意義。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)“優(yōu)鱸3號”(GS-01-001-2018)是2019年經全國水產原種和良種審定委員會審定通過的新品種之一，是以“優(yōu)鱸1號”(GS01-004-2010)和從美國新引進的北方亞種為基礎選育種群，采用群體選育和分子生物學技術相結合的方法，經連續(xù)4代選育而獲得。在投喂人工配合飼料的養(yǎng)殖條件下，與“優(yōu)鱸1號”和未選育群體相比，“優(yōu)鱸3號”稚魚馴化時間明顯縮短，幼魚和成魚的生長速度較快，養(yǎng)殖5～7個月即可達到上市規(guī)格，適合在我國淡水水域進行人工配合飼料養(yǎng)殖[7]。“優(yōu)鱸3號”作為水產領域的新星，將會迎來廣闊的養(yǎng)殖前景，但關于其研究還較少，目前尚未見到有關“優(yōu)鱸3號”在溫度脅迫下的各項機能反應的報道。同時，肝臟作為魚類最主要的代謝器官，在魚類適應溫度變化的過程中發(fā)揮重要作用[8]。因此本文以大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”為研究對象，探究了其在急性溫度脅迫下的存活率、肝臟抗氧化酶活性和非特異性免疫應答，旨在為大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”應對高溫脅迫的機制和健康高效養(yǎng)殖提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗處理

實驗所用大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”幼魚(體質量(9.87±1.2)g，體長(7.9±0.4)cm)均來自江蘇南京帥豐飼料有限公司，將實驗用魚暫養(yǎng)于有生物過濾水再循環(huán)系統(配備有冷卻和加熱功能，流速為5 L/min，光照時間為14 h)的水族箱中。每天投喂兩次(8∶00～9∶00和20∶00～21∶00)江蘇南京帥豐飼料有限公司“優(yōu)鱸3號”專用飼料。整個暫養(yǎng)和實驗期間水體溶氧高于5 mg/L，氨氮與亞硝酸鹽低于0.01 mg/L，實驗前禁食24 h，實驗期間不投喂。

將各組幼魚在25 ℃水溫下暫養(yǎng)15 d后，對照組水溫保持在該溫度下恒定。將實驗組迅速轉入預調好水溫的水循環(huán)缸中(31 ℃、34 ℃、37 ℃)，每個實驗組包括四個平行，每個平行含有30尾幼魚，在相應的實驗水溫下保持至實驗結束，并于0、1、3、6、12、24、48 h記錄死亡幼魚個體數量。同時取6條幼魚的肝臟組織于液氮中速凍，然后轉移至-80℃中保存，用于酶活力的測定。

1.2 酶活性測定

準確稱取0.1 g肝組織，按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入0.9 mL的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液為10%的組織勻漿液，分裝置于-20 ℃冰箱備用。組織樣品的蛋白濃度、總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶酶活性測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，按照實際濃度做微小調整，選用最適濃度測量。

1.3 數據統計與分析

實驗所得數據均用平均值±標準差的方式表示，所有數據均用 SPSS 19.0進行統計分析。利用方差分析(One-way ANOVA)進行顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著，用最小顯著極差法(LSD)分析不同溫度脅迫下同一時間大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”酶活性的差異，以及同一溫度脅迫下不同時間大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”酶活性的差異。用Origin 8.6 繪圖。

2 結果與分析

2.1 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”存活率的影響

大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”在不同的溫度脅迫下表現出不同的存活率(圖1)。其中31 ℃組在整個實驗過程中均未出現死亡，34 ℃組在實驗24 h出現個體死亡，死亡率為3.33%，48 h存活率為93.33%。而37 ℃組，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”在6 h就出現死亡現象，實驗結束時大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”的存活率僅為50%。

圖1 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”存活率的影響Fig.1 Effect of acute temperature stress on survival rate of M.salmoides “Youlu No.3”

2.2 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟抗氧化酶活性的影響

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟中總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力變化見圖2。31 ℃和34 ℃實驗組T-SOD活力呈先升高再下降再升高的變化趨勢，31 ℃組在1 h達到第一個峰值(309.86 U/mgprot)后隨之下降，3 h時與對照組無顯著性差異，在6 h又開始上升并在48 h時達到最高值(421.58 U/mgprot)，顯著高于其他時間點；34 ℃組在3 h達到第一個峰值(299.25 U/mgprot)后隨之下降，12 h顯著低于對照組，24 h又開始上升，48 h顯著高于對照組。37 ℃組實驗組T-SOD活力呈先升高再下降的變化趨勢，在1 h達到峰值(298.26 U/mgprot)后隨之下降，在24 h與對照組無顯著性差異。

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟中過氧化氫酶(CAT)活力變化見圖3。各組CAT活力均呈先升高再下降的變化趨勢，且均在3 h達到最高值，分別為108.80、115.95、109.36 U/mgprot，顯著高于其他時間點(31 ℃組6 h組除外)。31 ℃和34 ℃實驗組CAT活力在48 h仍顯著高于對照組，37 ℃實驗組在24 h與對照組無顯著差異。31 ℃和34 ℃實驗組CAT活力在1-48 h內均顯著高于對照組(34 ℃組48 h除外)。

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力變化見圖4。31 ℃和34 ℃實驗組GSH-PX活力呈先升高再下降再升高的變化趨勢，31 ℃組在3 h達到第一個峰值(82.93 U/mgprot)后隨之下降，在24 h又開始上升并在48 h時達到最高值(108.41 U/mgprot)，顯著高于其他時間點；34 ℃組在6 h達到第一個峰值(85.69 U/mgprot)后隨之下降，在24 h與對照組無顯著差異，在48 h回升且顯著高于對照組。37 ℃實驗組GSH-PX活力呈先升高再下降的變化趨勢，在6 h達到峰值(90.02 U/mgprot)后隨之下降，在48 h與對照組無顯著性差異。

圖2 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟T-SOD活性的影響Fig.2 Effect of acute temperature stress on T-SOD activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”圖柱上方不同大寫字母表示同一實驗組不同時間的差異顯著( P<0.05)，不同小寫字母表示同一時間段內不同實驗組之間差異顯著(P<0.05)，下同。

圖3 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟CAT活性的影響Fig.3 Effect of acute temperature stress on CAT activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”

2.3 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟非特異性免疫相關指標的影響

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟溶菌酶(LZM)活力變化見圖5。各組LZM活力均呈先升高再下降的變化趨勢。31 ℃實驗組在1 h達到峰值(117.85 U/mgprot)，顯著高于對照組同時顯著高于其他時間點，之后緩慢下降，直至48 h仍顯著高于對照組。34 ℃實驗組CAT活力在6 h達到峰值(111.45 U/mgprot)，之后緩慢下降，48 h與對照組無顯著差異。37 ℃實驗組在6 h達到峰值(142.35 U/mgprot)后迅速下降至24 h與對照組無顯著差異。

圖4 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟GSH-PX活性的影響Fig.4 Effect of acute temperature stress on GSH-PX activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”

圖5 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟LZM活性的影響Fig.5 Effect of acute temperature stress on LZM activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟中堿性磷酸酶(AKP)活力變化見圖6。31 ℃實驗組在1 h迅速升高后基本保持不變，均顯著高于對照組。34 ℃和37 ℃實驗組AKP活力均在1 h達到峰值(分別為96.65 U/mgprot和80.73 U/mgprot)，之后緩慢下降，34 ℃組顯著高于對照組，37 ℃實驗組24 h與對照組無顯著差異。

圖6 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟AKP活性的影響Fig.6 Effect of acute temperature stress on AKP activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”

急性溫度脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟中酸性磷酸酶(ACP)活力變化見圖7。各組ACP活力均在6 h達到最高值，分別為84.17、87.93、90.48 U/mgprot，均顯著高于對照組。31 ℃和34 ℃實驗組在3 h下降至對照組水平，在6 h又升高，且顯著高于對照組，隨后又下降，直至48 h仍顯著高于對照組。34 ℃組24 h與對照組無顯著差異，37 ℃實驗組12 h與對照組無顯著差異，48 h顯著低于對照組。

圖7 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”肝臟ACP活性的影響Fig.7 Effect of acute temperature stress on ACP activities in liver of M.salmoides “Youlu No.3”

3 討論

3.1 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”存活率的影響

溫度是影響魚類生存重要的環(huán)境因子之一， 主要對魚類代謝反應起控制作用，從而能夠影響魚類的成活率[9-11]。由試驗結果可知，在急性溫度脅迫下，34 ℃時大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”的成活率高達95%以上，而37 ℃組的成活率已低至50%。由此可見，37 ℃高溫對于大口黑鱸 “優(yōu)鱸3號”幼魚的生存已經構成威脅，因此，在培育大口黑鱸 “優(yōu)鱸3號”魚苗時溫度應該保持在34 ℃以下，否則會造成稚、幼魚的大量死亡。當溫度高于22 ℃后，異齒裂腹魚(Schizothoraxoconnori)幼魚存活率顯著降低，當溫度為32 ℃時，存活率為0[11]；太平洋鱈(Gadusmicrocephalus)15 ℃高溫脅迫下的成活率僅為43.3%[12]。因此，在大規(guī)模健康養(yǎng)殖中應時刻注意由于高溫天氣導致的魚類死亡而帶來的經濟損失，在夏季連續(xù)高溫等極端天氣來臨之前應做好相應的防護措施，例如配備能夠迅速降溫的制冷系統等。

3.2 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號” 抗氧化性相關指標的影響

魚類在正常生理代謝中會產生有害的氧化自由基，但是魚體內一般都存在清除自由基的抗氧化體系，使自由基處于一個正常水平，維持魚體內正常的代謝活動[13]。但是當生物受到環(huán)境因子脅迫時，生物體就會產生過量的活性氧和氧自由基，打破生物體內活性氧代謝的平衡，如不及時消除就會造成生物體活性氧傷害。SOD作為生物防御系統中重要的抗氧化酶，可以消除過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子等過量的自由基，同時CAT將SOD與自由基反應生成的 H2O2轉化為水，去除體內H2O2，保護細胞免受H2O2毒性，此外，GSH-PX可以特異性地催化GSH和H2O2的還原，從而保護細胞膜的結構和功能[14]。因此，SOD、CAT、GSH-PX等一些抗氧化酶通過協同作用共同清除生物體內的氧自由基，從而維持機體正常代謝，可以作為判斷生物體健康狀況及其抗氧化防御能力的重要指標[12]。在本研究中，隨著溫度的升高和脅迫時間的增加，大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”的T-SOD 、CAT、GSH-PX酶活性迅速升高，且顯著高于對照組，類似的結果也出現在溫度脅迫后的軍曹魚(Rachycentroncanadum)[15]、毛蚶(Scapharcasubcrenata)[16]、太平洋鱈(Gadusmicrocephalus)[12]等，這可能是因為在脅迫初期，魚體內產生大量自由基，各種抗氧化酶的活性被激發(fā)增強以清除過量的自由基，并通過適應性調節(jié)相關生理活動使得機體維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，說明這三種酶在魚類應對高溫脅迫中發(fā)揮了作用[17]。不同的是，在31 ℃、34 ℃、37 ℃溫度脅迫下，大口黑鱸 “優(yōu)鱸3號”的T-SOD酶活性分別在1 h、3 h、1 h達到第一個峰值，而CAT酶活性則均是在3 h達到峰值，GSH-PX酶活性分別在3 h、6 h、6 h達到第一個峰值，表明與總超氧化物歧化酶相比，過氧化氫酶和谷胱甘肽轉移酶酶活性的變化有明顯的滯后性，同樣的結果也出現在溫度脅迫后的太平洋鱈[12]中，這說明魚類的總超氧化物歧化酶酶活性較過氧化氫酶更易受環(huán)境因子的影響。另外，在31 ℃和34 ℃溫度脅迫后期，T-SOD和GSH-PX酶活性均有不同程度的回升，尤其31 ℃實驗組更是在48 h達到最大值，原因可能是較低程度的增溫，機體有能力清除由于應激產生的氧自由基，并保持較高的酶活性來適應環(huán)境的變化以保持體內平衡，存在抗熱鍛煉的可能性[5,18]，是一種積極的調節(jié)活動。

3.3 急性溫度脅迫對大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”非特異性免疫相關指標的影響

LZM是生物體吞噬細胞內溶酶體的標志酶，具有防御和免疫調節(jié)等生理作用[19]，而AKP 和ACP是兩種非特異性磷酸水解酶，能催化磷酸單酯的水解，打開磷酸酯鍵，釋放磷酸離子，促使磷酸基團的轉移反應，從而廣泛參與調節(jié)生物體生長代謝、保持內環(huán)境穩(wěn)定以及維持機體健康，且其功能作用會受到營養(yǎng)狀況、疾病及環(huán)境變化的影響[20,21]。當魚體的免疫水平發(fā)生變化時，它們也會產生相應的變化，因此它們可以作為水產動物在環(huán)境脅迫下反映非特異性免疫功能的指標。本實驗結果表明在溫度脅迫后初期，大口黑鱸 “優(yōu)鱸3號” LZM、AKP和ACP活力均有不同程度的上升趨勢，且顯著高于對照組，產生此現象原因可能是在脅迫初期魚體受到應激導致分泌水解酶的能力增強，使之濃度升高，活力增強。這與高溫脅迫后吉富品系尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[22]、銀鯧(Pampusargenteus)[21]相關免疫酶活變化研究的結果相似。值得注意的是，在31 ℃和34 ℃脅迫過程中相關免疫酶活顯著高于對照組，表明與25 ℃比較而言，31 ℃和34 ℃下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”具有更高的生理代謝和免疫水平，適當增加水溫可以保證魚體的免疫能力的充分發(fā)揮，減少疾病的發(fā)生。同樣的，吉富品系尼羅羅非魚[22]在31 ℃水溫中的AKP和LZM活力顯著高于25 ℃，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)在27 ℃水溫中的AKP活力顯著高于24 ℃。此類相似的結果也在大比目魚(Hippoglossushippoglossus)[23]、大西洋鯛(Sparusaurata)[24]等魚中獲得。但37 ℃脅迫后 AKP和ACP活力均呈現先上升再下降的趨勢，且在實驗結束時低于對照組，這可能是37 ℃的高溫造成一種不可逆轉的熱應激，從而使其代謝水平下降，表現為水解酶AKP 和ACP活性的降低，這與37 ℃脅迫后大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”死亡率的結果一致。本研究結果表明，37 ℃已經成為大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”的致死溫度，在日常養(yǎng)殖生產中，需要密切關注池塘溫度的變化，減少溫度應激，增加魚體免疫力，提高抗病害能力。同時做好應對高溫天氣的防護措施。