解華曉，鐘利橋，吳路銀，姚 凡,3，倪朝輝

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中上游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，武漢 430223；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070)

十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)是一種廣泛使用的阻燃劑[1]，屬于持久性有機(jī)污染物，在環(huán)境中很難被降解，且具有生物累積性，并會(huì)通過食物鏈損害人體健康[2]。在水、土壤、沉積物、灰塵、鳥類、魚類和哺乳動(dòng)物等樣品中均能檢測(cè)出BDE-209[3-4]， BDE-209的毒性作用包括發(fā)育毒性[5-7]、甲狀腺毒性[8,11]、生殖毒性[9-10]等。高濃度BDE-209可以殺死大部分太平洋鱈(Gadusmacrocephalus)精子[12]，暴露于BDE-209的斑馬魚(Daniorerio)親本可以將BDE-209轉(zhuǎn)移到子代并且可引起子代的發(fā)育毒性和甲狀腺內(nèi)分泌紊亂[13]。BDE-209會(huì)對(duì)黑頭呆魚(Pimephalespromelas)的肝臟造成肝臟細(xì)胞核空泡化[14]。歐盟委員會(huì)將BDE-209作為管控物質(zhì)，并規(guī)定2019年3月2日之后，所有物品中BDE-209的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過0.1%[14]。

目前，有關(guān)BDE-209的毒性研究集中于特定單一環(huán)境條件下對(duì)生物的毒理影響。然而在自然條件下，魚類的生殖發(fā)育與溫度有很大關(guān)系[18]。溫度作為重要的非生物因子不僅影響魚類的生理活動(dòng)，也對(duì)暴露在化學(xué)成分中的生物體的毒性反應(yīng)有很強(qiáng)的響應(yīng)。因此，有必要對(duì)不同溫度下的環(huán)境污染物的毒理效應(yīng)做進(jìn)一步研究。本研究通過體外染毒的方式探討不同溫度下BDE-209對(duì)草魚離體肝臟組織的毒性效應(yīng)，為BDE-209對(duì)水生生物的毒理影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇健康的草魚(Ctenopharyngodonidellus)作為試驗(yàn)用魚，試驗(yàn)所用草魚購自仙桃養(yǎng)殖場(chǎng)，其體長(zhǎng)為(17.41±0.63)cm，體重為(49.67±4.28)g，試驗(yàn)開始前試驗(yàn)魚在水族箱中馴養(yǎng)兩周，每天定時(shí)投喂餌料兩次，取樣前禁食一天。

試驗(yàn)所用BDE-209的純度大于95%(AccuStandard，美國)，二甲亞砜(DMSO)的純度大于99%(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，將BDE-209溶于DMSO配成1 mg/mL的母液，再按要求稀釋成所需，避光保存。

試驗(yàn)所用儀器有超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技公司)、低溫冷凍離心機(jī)(centrifuge 5415R，Eppendorf公司)，酶標(biāo)儀(SYNERGY/2，bioTek公司)、分光光度計(jì)(UV-1800PC，biotech 公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)置15、25、35 ℃三種溫度，每個(gè)溫度組BDE-209設(shè)置四個(gè)濃度梯度，分別為0.00、0.04、4.00、400.00 μg/L，每組設(shè)六個(gè)重復(fù)。草魚肝臟組織勻漿液的制備：取馴養(yǎng)后的健康草魚幼魚約30尾，用紗布擦干其表面后，解剖取其肝臟組織，在4 ℃的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙擦干后對(duì)肝臟組織稱重，按1∶9(w/v)的比例加入生理鹽水(4 ℃)，用眼科剪剪碎組織后超聲波勻漿，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的組織勻漿液?；靹蚝蠓盅b在72個(gè)2 mL EP管中，每管1.5 mL(勻漿液制備及加污染物過程均在冰浴中進(jìn)行)，加入不同濃度的BDE-209混勻后分別置于15、25、35 ℃的水浴鍋中孵育60 min，然后低溫離心取上清分裝，-80 ℃冰箱中保存，用于各指標(biāo)的測(cè)定。

SOD、CAT、GR以及MDA測(cè)定參照試劑盒(購自南京建成生物研究所)說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式來體現(xiàn)，同時(shí)用One-Way ANOVA方差分析進(jìn)一步分析(SPSS 13.0)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度下BDE-209對(duì)草魚離體肝臟組織SOD活性的影響

低溫時(shí)(15 ℃)BDE-209各濃度組與對(duì)照組無顯著性差異，常溫時(shí)(25 ℃)4.00 μg/L BDE-209染毒的肝臟組織SOD活性與對(duì)照組相比顯著性升高；高溫時(shí)(35 ℃)0.04 、4.00、400.00 μg/L濃度組與對(duì)照組相比SOD活性顯著性降低(圖1)。

圖1 不同溫度下BDE-209對(duì)草魚離體肝臟組織SOD活性的影響Fig.1 Effects of BDE-209 on SOD activity in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6)。下圖同。

2.2 不同溫度下BDE-209對(duì)草魚離體肝臟組織CAT活性的影響

低溫時(shí)(15 ℃)BDE-209各濃度組CAT活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，但差異性不顯著；常溫時(shí)(25 ℃)，0.04 μg/L 濃度組CAT活性與對(duì)照組相比極顯著性升高、4.00 μg/L 濃度組CAT活性與對(duì)照組相比顯著性降低,400 μg/L組CAT活性比對(duì)照組極顯著降低。高溫時(shí)(35 ℃)，各濃度組都比對(duì)照組CAT活性顯著性降低(圖2)。

圖2 不同溫度下BDE-209對(duì)草魚離體肝臟組織CAT活性的影響Fig.2 Effects of BDE-209 on CAT activity in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures

2.3 不同溫度下BDE-209對(duì)草魚離體肝臟組織GR活性的影響

低溫時(shí)(15 ℃)BDE-209各濃度組GR活性與對(duì)照組相比無顯著變化，常溫時(shí)(25 ℃)4.00 μg/L BDE-209暴露組GR活性與對(duì)照組相比呈顯著性升高，400.00 μg/L BDE-209暴露組GR活性與對(duì)照組相比呈顯著性降低，高溫時(shí)(35 ℃)各BDE-209暴露組GR活性與對(duì)照組相比均呈顯著性降低(圖3)。

圖3 不同溫度下BDE-209對(duì)草魚離體肝臟組織GR活性的影響Fig.3 Effects of BDE-209 on GR activity in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures

2.4 不同溫度下BDE-209對(duì)草魚離體肝臟組織MDA含量的影響

低溫時(shí)(15 ℃)BDE-209濃度為400.00 μg/L時(shí)MDA含量顯著升高；常溫時(shí)(25 ℃)BDE-209濃度為4.00 μg/L、400.00 μg/L時(shí)MDA含量與對(duì)照組相比顯著性升高；高溫時(shí)(35 ℃)BDE-209濃度為0.04、4.00、400.00 μg/L時(shí)MDA含量與對(duì)照組相比顯著升高(圖4)。

圖4 不同溫度下BDE-209對(duì)草魚離體肝臟組織MDA含量的影響Fig.4 Effects of BDE-209 on the content of MDA in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures

3 討論

3.1 不同溫度下BDE-209對(duì)草魚幼魚抗氧化酶的影響

通常情況下，生物體內(nèi)氧自由基的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡。如果體內(nèi)產(chǎn)生的自由基得不到及時(shí)有效的清除，就會(huì)通過損傷生物大分子破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，造成氧化損傷[19]，SOD和CAT組成魚體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著非常重要的作用。GR主要是維持組織內(nèi)還原態(tài)谷胱甘肽(GSH)的正常水平[20]，GSH是組織內(nèi)重要的抗氧化劑，在解毒代謝過程中GSH會(huì)被氧化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，而GR會(huì)重新催化GSSG還原為GSH[21]，所以GR在抗氧化體系中起重要作用。SOD、CAT、GR可以消除氧自由基以減少有害物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損傷[22]。在本研究中，不同濃度的BDE-209在相同的溫度下SOD、CAT、GR活性趨勢(shì)變化相似，在低溫(15 ℃)時(shí)，BDE-209各濃度組酶活與對(duì)照組相比無顯著性差異，在常溫(25 ℃)時(shí)，SOD、CAT、GR活性均有先升高后降低的現(xiàn)象，而高溫(35 ℃)處理下，各 BDE-209濃度組酶活性與對(duì)照組相比均顯著性降低，白秀娟等[23]通過研究不同溫度條件下文昌魚(Branchiostomabelcheri)對(duì)銅離子和鋅離子的耐受性也發(fā)現(xiàn)在相同Zn2+條件下，18 ℃時(shí)文昌魚存活率最高，超過這個(gè)溫度，文昌魚存活率降低，這說明溫度會(huì)影響污染物對(duì)生物體的毒性作用。Tang等[24]通過研究五溴聯(lián)苯醚對(duì)大型蚤毒性作用也發(fā)現(xiàn)SOD和CAT在低濃度的五溴聯(lián)苯醚的作用下有顯著升高現(xiàn)象。Chi等[25]研究了BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)的人體紅細(xì)胞(hRBCs)也發(fā)現(xiàn)BDE-209會(huì)誘導(dǎo)SOD CAT酶活性升高。這可能是由于在低溫條件下BDE-209引起肝臟組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)較小，而在常溫和高溫條件下BDE-209對(duì)魚體肝臟組織造成了氧化脅迫，使機(jī)體產(chǎn)生過多的氧自由基，氧自由基得不到及時(shí)有效的清除就會(huì)對(duì)機(jī)體造成氧化損傷，所以在高溫時(shí)SOD、CAT、GR活性均受到抑制應(yīng)該是BDE-209已經(jīng)對(duì)肝臟組織造成氧化損傷。張喆等[26]通過研究BDE-209對(duì)菲律賓蛤仔外套膜的氧化損傷也發(fā)現(xiàn)SOD和CAT在清除BDE-209脅迫產(chǎn)生的氧自由基過程中發(fā)揮重要作用，高濃度的BDE-209會(huì)抑制抗氧化酶的活性，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似。

3.2 不同溫度下BDE-209對(duì)草魚幼魚脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的影響

MDA是一種脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物，MDA的含量可直接反映機(jī)體組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映組織細(xì)胞損傷的程度[27]。在本研究中同一溫度下，常溫組和高溫組隨著BDE-209濃度的升高M(jìn)DA含量顯著升高，可見在一定溫度范圍內(nèi)溫度越高BDE-209對(duì)組織細(xì)胞的損傷越大，武艷華[28]研究表明汞在高溫狀態(tài)下對(duì)草魚肝臟細(xì)胞造成的損傷更大，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。這表明高濃度的BDE-209會(huì)對(duì)組織細(xì)胞造成嚴(yán)重的氧化損傷。Wang等[29]在BDE-209對(duì)大鼠甲狀腺的毒性研究中發(fā)現(xiàn)BDE-209會(huì)造成大鼠甲狀腺的氧化損傷，其MDA含量也有顯著升高現(xiàn)象。