陸玲娜 韓文倫

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種自身免疫性疾病，與免疫耐受機(jī)制的逐漸惡化有關(guān)。目前主要認(rèn)為B 淋巴細(xì)胞多克隆活化與T、B 淋巴細(xì)胞凋亡紊亂與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［1］。研究認(rèn)為B 細(xì)胞通過分泌IL10 參與免疫抑制，并與自身免疫性疾病具有相關(guān)性［2］。B 細(xì)胞還可以通過分泌IL-35 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能［3-4］。IL-35（p35/Ebi3）屬于IL-12 家族成員，其特征在于由α 鏈（p35）和β 鏈（Ebi3）相互作用形成的異二聚體，被認(rèn)為主要由調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分泌，并在體外和體內(nèi)疾病模型被證明具有抑制T 細(xì)胞增殖的功能［5］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)B 細(xì)胞也能夠分泌IL35，同樣具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，且與在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中證明B 細(xì)胞分泌的IL35 與自身免疫性疾病具有相關(guān)性［4］。本文探討SLE 活動(dòng)期與靜止期CD19+EBI3+p35+B細(xì)胞（IL35+B 細(xì)胞）的表達(dá)變化及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2017 年8 月至2018 年8 月本院系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者41 例，男6 例，女35 例；年齡15～69 歲，平均年齡36.3 歲。均符合1997 美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。SLE 疾病活動(dòng)性通過疾病活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）判斷，其中初發(fā)、未治療的活動(dòng)期SLE 患者16 例（SLEDAI＞9），穩(wěn)定期患者21 例（SLEDAI ≤9）口服潑尼松5～6g/d 維持治療。本院同期體檢健康者17 例為對(duì)照組，男1 例，女16 例；年齡20～75 歲，平均年齡38.4 歲。所有研究對(duì)象均采集EDTA 抗凝外周血標(biāo)本2ml。所有樣本均將巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、弓形蟲、輪狀病毒、柯薩奇病毒、支原體、衣原體、甲型肝炎B、C、D 病毒感染及其他自身免疫性疾病和慢性感染性疾病排除在外。本項(xiàng)目經(jīng)本院倫理評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意。

1.2 方法 （1）PBMC 制備與刺激：采用密度梯度離心法從EDTA 抗凝全血中分離出PBMC，將分離的PBMC 懸浮在添加10%胎牛血清、2mmol/L 谷氨酰胺和100U/ml 青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基（均購(gòu)于GIBCO 公司）中，加細(xì)胞刺激混合劑（BD 公 司，Cat：550583，）， 內(nèi) 含50ng/ml PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）、1μg/ml 離子霉素和10μg/ml brefeldin A。37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。（2）IL35+B 細(xì)胞測(cè)定：培養(yǎng)后PBMC 加FITC-CD19（Beckman coulter，Cat：A07768）胞外染色15min，使用Cytofix/Cytoperm kit（BD Biosciences，Cat：554714） 固 定破 膜， 加 入PerCP-IL12/IL-35 p35（Cat：IC2191C，R&D Systems），PE-IL12/IL35 EBI3（Cat：360904，Biolegend）胞內(nèi)染色15min，上機(jī)檢測(cè)。用未刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞作為同種型對(duì)照被用來(lái)確認(rèn)染色的特異性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，三組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，兩組間比較采用Mann Whitney U 檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用spearman 秩相關(guān)。P＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)期IL35+B 細(xì)胞表達(dá) 檢測(cè)三組IL35+Breg表達(dá)頻率，活動(dòng)期SLE為（1.063±1.467）%，穩(wěn) 定 期SLE 為（3.458±3.124）%， 健 康 對(duì) 照 組為（4.639±3.047）%。三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0002），活動(dòng)期SLE 患者IL35+B 細(xì)胞表達(dá)低于穩(wěn)定期SLE 與健康對(duì)照組（P=0.0019），穩(wěn)定期SLE 與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1）。

圖1 三組IL35+B細(xì)胞表達(dá)比較

2.2 IL35+B 細(xì)胞表達(dá)與SLEDAI 評(píng)分及其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性 SLE 患者IL35+B 細(xì)胞的表達(dá)與SLEDAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.4663，P=0.0036），而與補(bǔ)體C3、C4 水 平 呈 正 相 關(guān)（r=0.5878，P=0.0001；r=0.6242，P＜0.0001）。與IgG、IgA、IgM 未見相關(guān)性。見圖2。

圖2 spearman秩相關(guān)分析

3 討論

IL-35 是IL-12 家族的異源二聚體細(xì)胞因子的成員。由p35 和Ebi3 兩個(gè)亞基的組合形成［6］。IL-35 開始被發(fā)現(xiàn)僅由T 調(diào)節(jié)細(xì)胞（Treg）產(chǎn)生［7］。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)IL-35 還可以由耐受性樹突狀細(xì)胞［8］和B 細(xì)胞產(chǎn)生［9-10］。研究表明，IL-35 在免疫應(yīng)答中起重要的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，IL-35 表達(dá)降低與多種炎癥狀態(tài)有關(guān)，如炎癥性腸病、肝纖維化、心肌炎、腦脊髓炎和自身免疫性疾病，且與疾病的嚴(yán)重程度有相關(guān)性［11］。傳統(tǒng)認(rèn)為B 細(xì)胞是SLE 發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，這可能與B 細(xì)胞是固有免疫與適應(yīng)性免疫之間的重要連接有關(guān)，一方面B 細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞誘導(dǎo)特異性免疫，另一方面作為體液免疫的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答抗原。B 細(xì)胞也可以通過Toll 樣受體（TLR）的表達(dá)和一系列細(xì)胞因子的產(chǎn)生對(duì)自身或者外來(lái)抗原作出反應(yīng)，而這些細(xì)胞因子可以放大或下調(diào)免疫應(yīng)答［12］。但由B 細(xì)胞分泌的IL35 在SLE 中的作用尚不明確。

本研究顯示，SLE 活動(dòng)期組IL35+B 細(xì)胞表達(dá)明顯低于穩(wěn)定期組與健康對(duì)照組，而穩(wěn)定期組與健康對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且SLE 患者IL35+B 細(xì)胞的表達(dá)與SLEDAI 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。SLEDAI 是臨床上常用于評(píng)價(jià)SLE 活動(dòng)度的綜合評(píng)分系統(tǒng)，評(píng)分＞9 分為SLE 進(jìn)入活動(dòng)期，并隨著病情加重而評(píng)分上升。研究結(jié)果提示隨著SLE 活動(dòng)增強(qiáng)，IL35B+細(xì)胞表達(dá)下調(diào)。提示IL35+B 細(xì)胞可能參與SLE 活動(dòng)期的發(fā)生發(fā)展。隨著B細(xì)胞分泌的IL35 水平明顯降低，機(jī)體內(nèi)免疫抑制調(diào)節(jié)功能減弱，促炎反應(yīng)增強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡而誘發(fā)SLE［13］。而SLE 治療有效時(shí)可以上調(diào)IL35+B 細(xì)胞的表達(dá)，并能達(dá)到健康水平。表明隨著SLE 癥狀的緩解與穩(wěn)定，機(jī)體內(nèi)抑炎作用增強(qiáng)，促炎作用下調(diào)，并重新回到平衡狀態(tài)。

本資料結(jié)果顯示，SLE 患者IL35+B 細(xì)胞的表達(dá)與補(bǔ)體C3、C4 水平呈正相關(guān)。經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)參與SLE的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)建立。SLE 時(shí)，由自身抗體和免疫復(fù)合物激活的經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)可引起炎癥和組織損傷，同時(shí)補(bǔ)體C3、C4 被消耗［14］。但作為SLE 生物標(biāo)志物的C3 和C4 有幾個(gè)缺點(diǎn)。特別是正常血漿中的C3 和C4的范圍較寬，與正常血漿中的C3 和C4 重疊。此外，補(bǔ)體激活過程中消耗的C3 和C4 會(huì)導(dǎo)致合成增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平無(wú)變化?？偟腃3 和C4 水平不一定反映整個(gè)補(bǔ)體系統(tǒng)激活，雖然可溶性補(bǔ)體分裂產(chǎn)物（如C3a 和C4a）的增加可能在生理上更與補(bǔ)體激活有關(guān)，但其在血漿中穩(wěn)定性差，難以檢測(cè)。因此目前尚無(wú)取代C3 和C4 作為SLE 的生物標(biāo)志物。IL35+B 細(xì)胞的表達(dá)是否能作為新的指標(biāo)有待后期進(jìn)行大樣本的研究。

綜上所述，活動(dòng)期SLE 患者IL35+B 細(xì)胞的表達(dá)頻率明顯降低，且與SLEDAI 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與補(bǔ)體C3、C4 呈正相關(guān)。提示IL35+B 細(xì)胞在SLE 發(fā)病機(jī)制中可能具有重要作用，可能成為新的生物學(xué)指標(biāo)。IL35+B 細(xì)胞對(duì)SLE 的具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。