明紅霞， 張穎雪,2， 金 媛， 蘇 潔， 石 巖,2， 樊景鳳

(1. 國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心， 大連 116023； 2. 大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院， 大連 116023)

弧菌屬是海洋環(huán)境中的土著微生物，在目前發(fā)現(xiàn)的30余種弧菌中,至少有12種對人類具有致病性，常引起嚴重腹瀉和脫水。其中，創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌是最常見的弧菌病的病原[1]，而霍亂弧菌作為人類霍亂的病原體能引起世界性大流行，每年約有286萬感染病例，死亡人數(shù)達9.5萬[2]。由于氣候變化的影響，弧菌在環(huán)境中的存活條件發(fā)生了改變，導致其分布范圍擴大，致病性增強[3]。

海水浴場作為重要的公共場所，近20年來弧菌疾病暴發(fā)案例顯著增加[4]。因此，保護公眾因暴露于被污染的娛樂用水而導致弧菌感染至關重要。目前國內外普遍采用的娛樂用水微生物評價指標——糞便污染指示細菌(FIB)并不能保護免受因弧菌感染導致的人體健康威脅[5-7]，主要原因是弧菌為海洋土著細菌，其濃度及其發(fā)病率主要受環(huán)境條件控制，而與外源糞便污染無關，這些環(huán)境條件也可能是導致弧菌病具有地域性或季節(jié)性[8]。到目前為止，其主要的環(huán)境影響因子尚不清楚[9]。因此，為更好保護公眾健康，本研究擬在開展海水浴場腸球菌評價的基礎上，以3種常見的病原弧菌為研究對象，分析其毒力基因標志物的污染情況，同時對其主要環(huán)境影響因子進行探討，以期為海水浴場疾病防控提供參考資料。

表1大連星海浴場和付家莊浴場采樣站位信息

1 材料與方法

1.1 采樣站信息及取樣方法

大連星海浴場和付家莊浴場為大連市內2個典型的海水浴場，日均客流量分別達4萬和2萬人，旅游高峰期可達5萬～6萬人，浴場衛(wèi)生狀況對游客至關重要。本研究選取這2個浴場為研究區(qū)域，按照平均布設且兼顧游泳人群密集區(qū)的原則，在距離岸邊約20 m的斷面，每隔50～100 m布設站位(表1)，于8月份至9月份游泳高峰季節(jié)，每逢周末或降雨后12 h內采集表層海水，星海浴場第一年布設5個站位，第二年布設9個站位(采集2年)，付家莊浴場布設6個站位(采集1年)，共采集134個海水樣品。每個站位采集表層海水3.5 L至無菌采樣桶中，冷藏保存，并于2 h內運回實驗室。采樣同時記錄天氣狀況，并現(xiàn)場用YSI測定水溫、鹽度等環(huán)境因子。

1.2 方法

1.2.1 腸球菌計數(shù)

參照ISO標準[10]中濾膜法檢測海水中的腸球菌，用0.45 μm孔徑的混合纖維素濾膜過濾100 mL水樣，將濾膜貼于含疊氮鈉的培養(yǎng)基上，于(36±2)℃培養(yǎng)(44±4) h，如果觀察到紅色、栗色或粉紅色菌落，則用消毒的鑷子將濾膜轉移至膽鹽-七葉苷-疊氮化物培養(yǎng)基上，于(44±0.5)℃培養(yǎng)2 h，觀察并記錄棕色或黑色菌落，每個樣品設置3個平行。

1.2.2 海水浴場中3種典型弧菌的毒力基因標志物分析

樣品處理：分別取1 L混勻樣品用0.22 μm孔徑的硝酸纖維素濾膜過濾，每個樣品設置3個平行。

DNA提?。河脽o菌剪刀把濾膜剪碎，采用Qiagen 強力土壤提取試劑盒(DNeasy power soil kit)提取細菌DNA，具體操作參照試劑盒說明書。

引物設計：分別根據(jù)霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的毒力基因hlyA、trh和vvh設計引物，分析其毒力基因標志物的污染情況，引物信息、PCR反應體系和反應條件參照郭建麗[11]和石巖[12]的研究。

結果確認：經(jīng)PCR反應后，用2%的瓊脂糖電泳檢測，如果確定反應為陽性，則進行克隆測序，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序確認，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中用BLAST進行檢索和同源性比較。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

為進一步分析糞便污染指示細菌腸球菌與3種病原弧菌、以及各細菌學指標與主要影響因子之間的關系，采用SPSS(V20.0)進行Pearson相關性檢驗。

2 結果

2.1 天氣狀況

采樣期間記錄了天氣狀況，風速范圍為0.3～7.9 m/s，風級為1～4級，氣溫為19.1 ℃～28.6 ℃，浪高為0.2～1.0 m，共記錄了5次降雨，結果詳見表2。

2.2 腸球菌的分布

經(jīng)分析，在所采集的134份樣品中，大連付家莊浴場和星海浴場腸球菌的濃度在0.3～12 000 CFU/100 mL之間，其中，付家莊浴場海水中其濃度范圍為3.3～5433 CFU/100 mL，平均濃度為997 CFU/100 mL，星海浴場海水中其濃度范圍為0.3～12 000 CFU/100 mL之間，平均濃度為1136 CFU/100 mL。根據(jù)美國環(huán)保署現(xiàn)行標準[13](腸球菌的濃度≤104 CFU/100 mL)，大連付家莊浴場和星海浴場腸球菌的超標率分別為66.7%(n=30)和55.8%(n=104)。

表2 采樣期間天氣狀況

本研究在付家莊浴場共采集5批次樣品，星海浴場共采集16批次樣品，其腸球菌分布詳見圖1和2。付家莊浴場降雨后(n=1)腸球菌平均濃度達3717 CFU/100 mL，而降雨前2 d其平均濃度為131 CFU/100 mL，降雨后星海浴場腸球菌平均濃度為2298 CFU/100 mL(n=4)，而降雨前2～3 d其平均濃度為53 CFU/100 mL。與晴天相比，降雨后(12 h內)腸球菌濃度顯著升高(P<0.01)。星海浴場第3次采樣前天夜里發(fā)生較大范圍降雨(28 mm)，腸球菌濃度顯著升高，雖然第4次采樣前一天有小范圍降雨(10 mm)，但因與第3次采樣只有2 d間隔，腸球菌濃度并未繼續(xù)升高，相比而言，第5次采集的漲潮時樣品中腸球菌濃度反而較高，該情況與第8次采樣結果類似。

2.3 3種病原弧菌毒力基因標志物的分布

兩個典型海水浴場中副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的毒力基因陽性檢出率為分別為24.6%、4.5%和10.4%，各浴場檢測結果詳見表3。3種弧菌的毒力基因在降雨前后無顯著差異，同一浴場不同站位之間分布也無顯著差異。其中，副溶血弧菌在兩個浴場所有站位均有檢出；除個別站位(F2、F5、F6、X9)外，創(chuàng)傷弧菌在兩個浴場其余站位也均有檢出；除個別站位(F6)外，付家莊浴場在其余5個站位均有霍亂弧菌檢出，但是該病原菌在星海浴場各站位均未檢出。

圖1 大連付家莊浴場各采樣站位腸球菌的分布

2.4 指示細菌與3種病原弧菌的關系

分析數(shù)據(jù)表明，在134個樣品中，有78個樣品腸球菌超標，其中有18個樣品檢出了副溶血弧菌毒力基因，占副溶血弧菌陽性檢出率的54.5%(18/33)；有4個樣品為創(chuàng)傷弧菌陽性，占創(chuàng)傷弧菌陽性檢出率的28.6%(4/14)；有3個樣品為霍亂弧菌陽性，占霍亂弧菌陽性檢出率的50%(3/6)。

表3 大連付家莊浴場和星海浴場表層海水中 弧菌毒力基因標志物檢測結果

圖2 大連星海浴場各采樣站位腸球菌的分布

Figure 2 Distribution of enterococci at each sampling site in Xinghai bathing beach

SPSS相關性檢驗結果表明(表4)，腸球菌與創(chuàng)傷弧菌呈負相關關系，與副溶血弧菌和霍亂弧菌無相關性，而這兩種弧菌則呈顯著正相關關系。由此可見，腸球菌與3種病原弧菌的生態(tài)特征差異較大。而在3種弧菌中，副溶血弧菌與霍亂弧菌生態(tài)特征較為相近。

表4 Pearson相關性檢驗細菌學指標之間以及其與環(huán)境因子的相關性

注：對霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、腸球菌等生物學指標以及降雨量、水溫、pH值、鹽度、透明度、濁度、葉綠素a、DO等指標進行了Pearson相關性分析，其中“*”代表相關，“**”代表顯著相關

2.5 主要環(huán)境、氣象影響因素的篩選

選取水溫、pH值、鹽度、透明度、濁度、葉綠素a、DO、潮汐、風速、風向、降雨量等指標，采用SPSS(V20.0)進行Pearson相關性檢驗，分析了細菌學指標的主要環(huán)境、氣象影響因素。結果表明(表4)，腸球菌與風速、浪高、降雨量均呈顯著正相關關系，與DO、pH值、透明度均呈負相關關系。副溶血弧菌與浪高呈顯著負相關關系，與pH值呈正相關關系，創(chuàng)傷弧菌與鹽度、透明度呈顯著正相關關系，與水溫、氣溫呈負相關關系。而本研究中霍亂弧菌與所測環(huán)境因子均無相關性。通過細菌學指標與環(huán)境、氣象要素相關性分析進一步證明，腸球菌與3種弧菌的生態(tài)學差異較大，不能用腸球菌來指示3種弧菌的污染。

3 討論

目前國內外海洋娛樂用水標準均采用糞大腸菌群、腸球菌等指示細菌來保護公眾暴露于糞源病原細菌的安全[13-15]，然而，海洋土著微生物在娛樂安全用水中同樣發(fā)揮著重要的作用。我國對病原弧菌的關注主要集中在臨床、養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖水體中[16-18]，因缺少相關流行病學調查和臨床數(shù)據(jù)分析，海水浴場中病原弧菌的感染風險尚未引起足夠的重視，目前僅見雷鎧璐等人對青島第一和第六海水浴場中的副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌進行了分析[19]，王若純等人對青島沿海淺水中溶藻弧菌的分布研究[20]，但均基于選擇性培養(yǎng)基對弧菌的篩選，雖然已結合生理生化鑒定，但是并不能確定其致病性。

隨著分子生物學的發(fā)展，國內外大多數(shù)根據(jù)毒力基因來研究環(huán)境中病原弧菌的分布特征[21]。本研究顯示，在大連付家莊浴場和星海浴場中副溶血弧菌的毒力基因檢出率最高(24.6%)，其次是創(chuàng)傷弧菌，檢出率最低的是霍亂弧菌。副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的毒力基因在大連兩個海水浴場中的分布差異不大，而霍亂弧菌只在付家莊浴場檢出。不同的弧菌地理分布差異較大，可能與鹽度、溫度、營養(yǎng)成分以及或原生動物捕獲等因素有關[22-23]，同時與采樣當時的天氣現(xiàn)象，如浪高、風速等有關。本研究結果也顯示不同弧菌的主要環(huán)境影響因子也不相同，進一步導致其生態(tài)學分布特征的差異。

研究表明，創(chuàng)傷弧菌是最危險的弧菌病原，其感染后死亡率可高達20%～25%，如果感染過程伴有敗血癥，其死亡率可高達60%[24]。霍亂弧菌(non O1/O139)是第二大危險弧菌病原，雖然其死亡率較低，但在高危人群中，死亡率會顯著增加——尤其是老人、肝病患者和免疫系統(tǒng)受損者[25]。與上述兩種弧菌相比，副溶血弧菌造成的死亡人數(shù)最少，在娛樂用水中常導致傷口和耳朵感染[26]。本研究通過檢測弧菌毒力基因標志物，證明3種弧菌在大連代表海水浴場中均有潛在的感染風險。由此可見，目前僅用糞便污染指示細菌來評價浴場水質安全狀況難以保證公眾安全，亟須開展常見病原弧菌的毒力基因標志物分析。此外，我國乃至世界范圍內對弧菌的風險評估工作還停留在食品安全領域[27]，尚無適用于海水浴場常見弧菌的風險評估模型[28]，因此未來亟須加強該領域的研究，實現(xiàn)弧菌的人體健康風險評估，預防和減少相關疾病的發(fā)生。