朱孟濤,劉秀霞,王佳盟,劉志偉,鄭聚鋒,卞榮軍,王艮梅,張旭輝,李戀卿,潘根興

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境研究所, 南京 210095 2 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 南京 210037 3 江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210095

生物質(zhì)炭是生物質(zhì)在限氧條件下經(jīng)過(guò)熱裂解產(chǎn)生的高度芳香化的有機(jī)物質(zhì),具有比表面積大、吸附能力強(qiáng)、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)[1],其農(nóng)業(yè)應(yīng)用被認(rèn)為是有效增加土壤碳固定與減緩氣候變化的重要途徑[2- 3]。研究表明,生物質(zhì)炭在土壤中施用有多重效應(yīng),如改善土壤理化性質(zhì)、增加土壤有機(jī)碳含量、提升保水性能、減少溫室氣體排放、降低養(yǎng)分淋失和提升作物產(chǎn)量等作用[4- 6]。此外,生物質(zhì)炭施用還能顯著影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和活性[7- 8],由于土壤中的諸多物質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程(如溫室氣體產(chǎn)生)大多依賴于土壤微生物的調(diào)節(jié),因此,研究生物質(zhì)炭施用對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響對(duì)于深刻認(rèn)識(shí)土壤的微觀過(guò)程機(jī)制具有重要意義[9]。

目前,已有大量研究開始采用不同分子生物學(xué)技術(shù)(如PLFA、高通量測(cè)序等)探索生物質(zhì)炭施用下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化及其與溫室氣體排放的關(guān)系,如Feng等[10]發(fā)現(xiàn)施用不同溫度制備的生物質(zhì) 炭(300,400,500℃)顯著降低土壤甲烷的排放,進(jìn)一步通過(guò)高通量測(cè)序表明甲烷氧化菌和產(chǎn)甲烷菌相對(duì)變化是CH4排放降低的主要原因；Sheng和Zhu[11]研究發(fā)現(xiàn),生物質(zhì)炭在酸性土壤中施用會(huì)導(dǎo)致富營(yíng)養(yǎng)型微生物(擬桿菌門、芽單孢菌門等)豐度增加,而在堿性土壤中會(huì)使貧養(yǎng)型微生物(酸桿菌門)增加；Chen等[12]發(fā)現(xiàn)在旱地土壤中施用小麥秸稈(350—550℃)生物質(zhì)炭(0,20,40 t/hm2)三年后,40 t/hm2生物質(zhì)炭處理中放線菌門、γ-變形菌綱、厚壁菌門和子囊菌門的豐度顯著降低,同時(shí)顯著降低土壤呼吸對(duì)溫度的敏感性。另外,有研究指出,生物質(zhì)炭施用顯著增加革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌比例(G+/G-)的同時(shí)降低了真菌與細(xì)菌的比例[13]。這些結(jié)果表明微生物群落結(jié)構(gòu)或活性在生物質(zhì)炭不同施用時(shí)間尺度下均發(fā)生了改變,但由于生物質(zhì)炭原料、制備工藝、生產(chǎn)條件以及土壤類型存在較大差異,生物質(zhì)炭施用對(duì)微生物的影響程度存在不同結(jié)果。除此以外,生物質(zhì)炭施入土壤后與土壤顆粒相互作用形成的“生物質(zhì)炭-土壤顆?！蔽⑾到y(tǒng)可改變土壤微生物的生境,這可能對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及分布產(chǎn)生影響。然而到目前為止,這方面的研究還相對(duì)缺乏。

土壤團(tuán)聚體是土壤結(jié)構(gòu)的基本單元,對(duì)保持土壤水分和養(yǎng)分、協(xié)調(diào)土壤環(huán)境與微生物活性、維持土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要意義[14]。不同農(nóng)田管理措施(施肥、灌溉、耕作等)能不同程度的影響團(tuán)聚體穩(wěn)定性[15-16],同時(shí)伴隨著土壤養(yǎng)分、微生物群落結(jié)構(gòu)及酶活性變化[17-18]。隨著生物質(zhì)炭在土壤應(yīng)用中研究的深入,生物質(zhì)炭施用對(duì)土壤團(tuán)聚體的組成、分布以及穩(wěn)定性的影響已有報(bào)道[19],而且,不同團(tuán)聚體中有機(jī)碳組分及結(jié)構(gòu)也隨生物質(zhì)炭施用而發(fā)生變化[20-21]。盡管目前生物質(zhì)炭應(yīng)用對(duì)土壤微生物影響的研究已開展了大量工作,但主要集中在全土范疇[22- 23]。作為微生物在微觀尺度上的載體,土壤團(tuán)聚體粒組的分布在土壤施用生物質(zhì)炭條件下發(fā)生改變,這可能伴隨微域環(huán)境中有機(jī)物組成、孔隙、水分等生態(tài)因子的重組,從而導(dǎo)致微生物群落在不同粒組中的重新分配,進(jìn)而影響微域環(huán)境中的物質(zhì)和元素循環(huán)。然而,團(tuán)聚體尺度上土壤微生物群落結(jié)構(gòu)如何響應(yīng)于生物質(zhì)炭,不同團(tuán)聚體粒組中微生物對(duì)其響應(yīng)是否一致,目前都還少有報(bào)道。

為此,本試驗(yàn)選擇太湖地區(qū)施用生物質(zhì)炭?jī)赡旰蟮乃就翞檠芯繉?duì)象,采集表層(0—15 cm)原狀土壤,采用濕篩法[24]進(jìn)行團(tuán)聚體分組,并通過(guò)Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)土壤微生物進(jìn)行高通量測(cè)序,以期在團(tuán)聚體尺度上揭示生物質(zhì)炭施用對(duì)稻田土壤微生物群落和多樣性的影響。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)開始于2016年5月,地點(diǎn)位于江蘇省宜興市徐舍鎮(zhèn) (31°41′N, 119°73′E)。該地屬于亞熱帶季風(fēng)氣候,年均溫為15.7℃,年均降水量為1246.3 mm。土壤類型是太湖地區(qū)第四紀(jì)湖積物發(fā)育的典型脫潛型水稻土-烏泥土,種植制度為夏水稻-冬小麥輪作。試驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)處理,未施生物質(zhì)炭(C0)和生物質(zhì)炭處理(C15),小區(qū)面積為30 m2(5 m×6 m),每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù),完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。所施入的玉米秸稈生物質(zhì)炭在450℃下限氧燒制,于2016年5月水稻種植前按15 t/hm2的用量一次性施入土壤表層,通過(guò)翻耕使其與土壤均勻混合(0—15 cm)。生物質(zhì)炭基礎(chǔ)理化性質(zhì)為：有機(jī)碳含量431.00 g/kg,全氮含量為7.97 g/kg,C/N為51.82,速效磷含量為2.36 mg/kg,pH為8.79。土壤的基礎(chǔ)性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 供試土壤的基礎(chǔ)性質(zhì)

C0, 未施用生物質(zhì)炭處理 Soil without biochar amendment；C15,生物質(zhì)炭施用量為15 t/hm2的處理 Soil with biochar amendment at the rate of 15 t/hm2

1.2 土壤樣品采集與處理

土壤樣品于2018年4月采集,按照S形路線使用不銹鋼半圓柱專用采樣鏟采集表層土壤(0—15 cm),每個(gè)小區(qū)采集6個(gè)土壤樣品。將采集的原狀土置于不銹鋼收集罐后立即帶回實(shí)驗(yàn)室,按照自然裂隙掰成約1 cm3大小土塊并混合均勻。由于微生物對(duì)外界環(huán)境反應(yīng)迅速,因此,在樣品取回實(shí)驗(yàn)室24 h內(nèi)完成團(tuán)聚體樣品的分離。另一部分混合樣品風(fēng)干處理,剔除植物殘?bào)w及侵入體,以備土壤基礎(chǔ)性質(zhì)測(cè)定。

1.3 團(tuán)聚體分組

(1)土壤團(tuán)聚體分組根據(jù)Six等[24]的方法略加修改。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),稱取一定量新鮮土樣(相當(dāng)于50 g風(fēng)干土重)置于孔徑為2000 μm篩中,在室溫下(20±2)℃浸沒(méi)于無(wú)菌水中30 min,使水分充滿土壤孔隙。上下震蕩篩子,振幅在3 cm左右,頻率為每分鐘50次,震蕩3 min,使土壤全部過(guò)篩。將過(guò)篩后的土壤懸濁液置于250 μm篩中,按上述操作繼續(xù)震蕩3分鐘,然后將滯留于篩上的土壤顆粒用水清洗并轉(zhuǎn)移至離心管中,在4000 rpm的條件下離心30 min。將得到的團(tuán)聚體迅速置于-80℃冰箱冷藏。此步驟得到2000—250 μm土壤粒組(大團(tuán)聚體),以Mac表示。按上述步驟,進(jìn)一步可以得到250—53 μm土壤粒組(微團(tuán)聚體),以Mic表示,<53 μm的土壤粒組(粉、黏粒組分),以SC表示。并通過(guò)平均質(zhì)量直徑(MWD)和大于250 μm團(tuán)聚體的質(zhì)量比例(R0.25)兩個(gè)指標(biāo)表示團(tuán)聚體穩(wěn)定性。

團(tuán)聚體穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指標(biāo)：

(2)平均質(zhì)量直徑(MWD)

(3)大于250 μm團(tuán)聚體的質(zhì)量比例(R0.25)

式中,MR0.25表示大于250 μm團(tuán)聚體的質(zhì)量；MT表示團(tuán)聚體總質(zhì)量。

1.4 微生物高通量測(cè)序

使用PowerSoilR DNA 提取試劑盒 (Mo Bio Laboratories Inc., CA) 按說(shuō)明書提供的步驟對(duì)土壤樣品進(jìn)行細(xì)菌和真菌的 DNA提取,并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量。之后對(duì)細(xì)菌16S rRNA中的V3—V4高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列為 F338(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和R158(ATTACCGCGGCTGCTGG)；對(duì)真菌18S rRNA的ITS1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物為 1737F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和 2043R(TGCGTTCTTCATCGATGC)。擴(kuò)增后,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,之后切膠、回收、建立文庫(kù)并使用Illμmina Miseq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列。用usearch方法按照97%相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類(不含單序列)。通過(guò)Chao1指數(shù)評(píng)估群落中OTU數(shù)目,Shannon指數(shù)估算樣品中微生物多樣性。通過(guò)與細(xì)菌silva128數(shù)據(jù)庫(kù)和真菌Unite數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),使用Qiime平臺(tái)的Ribosomal Database Project (RDP) Classifier算法(70%置信度)生成不同分類水平的微生物豐度表,以此評(píng)估各團(tuán)聚體粒組中門、綱、目、科、屬、種(phylum, class, order, family, genus, species)水平細(xì)菌和真菌物種組成及相對(duì)豐度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用 Microsoft Excel 2016 進(jìn)行處理,SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析,采用Duncan法進(jìn)行顯著性差異比較(P< 0.05),最后用 OriginPro 2015進(jìn)行圖形繪制。利用Mothur軟件對(duì)每個(gè)樣品做α-多樣性指數(shù)(Chao1, Shannon)分析。在β-多樣性指數(shù)中,使用UniFrac軟件對(duì)PCA結(jié)果進(jìn)行分析以明確不同處理及團(tuán)聚體間微生物群落是否存在差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤團(tuán)聚體

由表2可知,C0和C15處理的質(zhì)量回收率分別為95.6%和97.7%。從團(tuán)聚體的分布來(lái)看,粉、黏粒組分在兩個(gè)處理中均比例最高,達(dá)到75.85%—80.49%；而大團(tuán)聚體和微團(tuán)聚體所占比例都在10%左右。與C0處理相比,生物質(zhì)炭施用下大團(tuán)聚體顯著增加42.00%,而粉、黏粒組分降低5.76%,同時(shí)MWD和R0.25分別顯著增加35.92%和21.05%。

表2 團(tuán)聚體分布和穩(wěn)定性指標(biāo)

Mac, 大團(tuán)聚體 macro-aggregates；Mic, 微團(tuán)聚體 micro-aggregates；SC, 粉、黏粒組分 silt-clay fraction；R0.25, 粒徑大于250 μm的團(tuán)聚體的質(zhì)量比例 ；MWD,平均質(zhì)量直徑 Mean weight diameter;表中不同小寫字母表示同一個(gè)處理內(nèi)部不同粒徑團(tuán)聚體間存在顯著差異,不同大寫字母表示同一粒徑的團(tuán)聚體在不同處理間存在顯著差異(P<0.05);圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)

2.2 OTU及α-多樣性

與C0處理相比,C15處理全土中細(xì)菌的OTU和Chao1指數(shù)分別升高12.39%,13.89%；真菌的OTU、Chao1和Shannon指數(shù)分別明顯升高27.60%,15.47%和12.32%。顯然施炭增加了全土微生物OTU和α-多樣性(表3)。就同一個(gè)處理內(nèi)不同粒徑團(tuán)聚體間而言,無(wú)論是C0還是C15處理,細(xì)菌的OUT、Chao1和Shannon指數(shù)均無(wú)明顯差異。而真菌在C15處理大團(tuán)聚體中的OTU明顯低于其他組分,同時(shí)微團(tuán)聚體的Shannon指數(shù)明顯低于粉、黏粒組分。從不同處理的同一團(tuán)聚體粒徑中的微生物來(lái)看,生物質(zhì)炭施用顯著提高了各粒徑團(tuán)聚體中細(xì)菌OTU數(shù)目和α-多樣性,但對(duì)真菌無(wú)顯著影響。

表3 不同處理下全土及團(tuán)聚體中微生物OTU及α-多樣性指數(shù)

OTU,操作分類單元 operational taxonomic unit；Chao1,豐富度估計(jì)量Chao1 richness estimator；Shannon,香農(nóng)多樣性指數(shù) Shannon diversity index;表中不同小寫字母表示同一個(gè)處理間不同粒徑團(tuán)聚體中的OTU及α-多樣性指數(shù)的顯著差異,不同大寫字母表示不同處理間相同粒徑團(tuán)聚體中OTU及α-多樣性指數(shù)的顯著差異(P<0.05);圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)

2.3 細(xì)菌和真菌多樣性

通過(guò)主成分分析(PCA)可以清晰的看出(圖1),兩處理間及團(tuán)聚體間微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。細(xì)菌和真菌的前兩個(gè)主要成分分別能夠解釋總變異度的55.86%和54.58%。在第一主成分上(PC1),C0和C15處理間的微生物均能顯著分開,這表明生物質(zhì)炭施用導(dǎo)致微生物的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化。在第二主成分上,對(duì)細(xì)菌而言,無(wú)論是C0還是C15處理,大團(tuán)聚體和微團(tuán)聚體間的距離較近,且與粉、黏粒組分顯著分開,這表明細(xì)菌在大團(tuán)聚體和微團(tuán)聚體中的群落相似,而與粉、黏粒組分存在較大差異。與細(xì)菌的變化有所不同,對(duì)真菌而言,C0處理中的大團(tuán)聚體與<250 μm組分(微團(tuán)聚體+粉、黏粒組分)的群落結(jié)構(gòu)在第二主成分上明顯分開。而在C15處理中,微團(tuán)聚體中的群落結(jié)構(gòu)有向大團(tuán)聚體群落結(jié)構(gòu)靠近的趨勢(shì)。這表明,生物質(zhì)炭的施用會(huì)使微團(tuán)聚體中的真菌群落結(jié)構(gòu)向著大團(tuán)聚體中群落結(jié)構(gòu)方向發(fā)展。

圖1 細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析(PCA)Fig.1 Principal component analysis of bacteria and fungusC0_Mac,C0處理中的大團(tuán)聚體組分樣本 The macro-aggregates fraction in C0 treatment；C0_Mic,C0處理中的微團(tuán)聚體組分樣本 The micro-aggregates fraction in C0 treatment；C0_SC,C0處理中的粉、黏粒組分樣本 The silt-clay fraction in C0 treatment；C0,C0處理的全土樣本 The bulk soil in C0 treatment；C15_Mac,C15處理中的大團(tuán)聚體組分樣本 The macro-aggregates fraction in C15 treatment；C15_Mic,C15處理中的微團(tuán)聚體組分樣本 The micro-aggregates fraction in C15 treatment；C15_SC,C15處理中的粉、黏粒組分樣本 The silt-clay fraction in C15 treatment；C15,C15處理的全土樣本 The bulk soil in C15 treatment

圖2為兩處理主要細(xì)菌門和目水平的相對(duì)豐度。本研究中共發(fā)現(xiàn)43個(gè)門,主要包括變形菌門(Proteobacteria),酸桿菌門(Acidobacteria),綠彎菌門(Chloroflexi),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),放線菌門(Actinobacteria),硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等。共發(fā)現(xiàn)263個(gè)目,主要包括β-變形桿菌目(Betaproteobacteriales),SBR1031,粘球菌目(Myococcales),厭氧繩菌目(Anaerolineales),根瘤菌目(Rhizobiales),溶菌目(Solibacterales)和芽單胞菌目(Gemmatimonadales)等。同一個(gè)處理中不同粒組團(tuán)聚體的微生物相對(duì)豐度存在差異。對(duì)C0處理而言,隨著團(tuán)聚體粒徑的增大,門水平的變形菌門、芽單胞菌門和硝化螺旋桿菌門以及目水平的β-變形桿菌目、芽單胞菌目的相對(duì)豐度逐漸降低,而酸桿菌門、粘球菌目、厭氧繩菌目、溶菌目的相對(duì)豐度逐漸升高。C15處理中,隨著團(tuán)聚體粒徑的增大,變形菌門、SBR1031、根瘤菌目的相對(duì)豐度升高,而硝化螺旋桿菌門、Patescibacteria、疣孢菌門(Verrucomicrobia)的相對(duì)豐度逐漸降低。施用生物質(zhì)炭顯著改變了土壤微生物的相對(duì)豐度。從全土來(lái)看,C15處理的酸桿菌門和芽單胞菌門的相對(duì)豐度比C0處理分別下降36.93%和16.44%,而變形菌門、硝化螺旋桿菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度分別增加23.38%,71.28%和31.31%。在目水平上,施炭導(dǎo)致厭氧繩菌目相對(duì)豐度下降32.86%,而β-變形桿菌目和根瘤菌目的相對(duì)豐度分別升高42.28%和22.89%。從不同粒組團(tuán)聚體中微生物的相對(duì)豐度來(lái)看,與C0處理相比,隨著團(tuán)聚體的粒徑增加,C15處理中的變形菌門相對(duì)豐度變化分別為-4.19%、7.05%和14.37%,變形菌門中的β-變形桿菌目的變化趨勢(shì)相似,分別為-3.92%,12.96%,33.82%；酸桿菌門分別下降0.40%,17.31%和20.15%,溶菌目分別降低25.85%,19.04%,19.59%；芽單胞菌門由降低34.50%和26.40%至無(wú)顯著變化(2.82%),相似的,芽單胞菌目的變化分別為-33.28%,-25.63%,7.02%。

圖2 細(xì)菌門、目水平相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundances of the dominant bacterial phyla and order under different treatments

圖3為兩處理主要真菌門和目水平的相對(duì)豐度。本試驗(yàn)樣本中共發(fā)現(xiàn)17個(gè)真菌門,主要包括子囊菌門(Ascomycota),鞭毛菌門(Mortierellomycota),擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)。共發(fā)現(xiàn)114個(gè)真菌目,主要包括被孢霉目(Mortierellales)、竹蓋菌目(Hypocreales)、糞殼菌目(Sordariales)、座囊菌目(Dothideomycetes)、格孢腔菌目(Pleosporales)和佩齊亞目(Pezizales)等。與細(xì)菌相似,同一個(gè)處理不同粒徑團(tuán)聚體間的真菌相對(duì)豐度存在差異,并且隨著團(tuán)聚體粒徑的增大,兩處理中均呈現(xiàn)出子囊菌門、羅茨菌門、格孢腔菌目相對(duì)豐度逐漸減少和擔(dān)子菌門、球囊菌門、類球囊霉目相對(duì)豐度增加的趨勢(shì)。從全土角度來(lái)看,C15處理中擔(dān)子菌門、球囊菌門的相對(duì)豐度比C0處理分別增加139.97%和18.88%,而子囊菌門相對(duì)豐度降低20.16%,其中,子囊菌門中的糞殼菌目和佩齊亞目的相對(duì)豐度分別顯著降低25.06%和81.88%。從土壤團(tuán)聚體角度來(lái)看,與C0處理相比,隨著團(tuán)聚體粒徑的增加(從粉、黏粒組分到大團(tuán)聚體粒組),C15處理中子囊菌門相對(duì)豐度的變化表現(xiàn)為-12.15%、19.93%和25.94%。竹蓋菌目相對(duì)豐度變化為-29.28%、-6.17%和35.52%。糞殼菌目在3個(gè)團(tuán)聚體粒組中都出現(xiàn)下降(-34.04%,-29.37%,-43.42%)。擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度在粉、黏粒組和微團(tuán)聚體中分別顯著增加90.52%和38.14%,而在大團(tuán)聚體粒組中無(wú)顯著變化。

圖3 真菌門、目水平相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundances of the dominant fungal phyla and order under different treatments

3 討論

3.1 生物質(zhì)炭對(duì)土壤團(tuán)聚體分布的影響

土壤團(tuán)聚體組成與分布受農(nóng)田管理措施顯著影響,生物質(zhì)炭施用可顯著改變其存在狀態(tài)。部分試驗(yàn)表明生物質(zhì)炭施用能顯著促進(jìn)團(tuán)聚體的形成[25],Yoo等[26]通過(guò)向種植水稻和牧草的土壤中分別添加5%的玉米秸稈及其制備的生物質(zhì)炭(450℃),培養(yǎng)18周后發(fā)現(xiàn),生物質(zhì)炭添加使微團(tuán)聚體(250—53 μm)增加超過(guò)200%；Liu等[25]以油菜-土豆輪作系統(tǒng)為對(duì)象,在中國(guó)亞熱帶山地紅壤中施用350—550℃小麥秸稈生物質(zhì)炭(0,2,5,10,20,30,40 t/hm2)后發(fā)現(xiàn),施炭顯著增加表層土壤中大團(tuán)聚體數(shù)量并且提高團(tuán)聚體MWD的28.02%。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于未施生物質(zhì)炭處理,施用生物質(zhì)炭?jī)赡旰蟠髨F(tuán)聚體顯著增加42.00%,而且土壤團(tuán)聚體的MWD和R0.25分別顯著增加35.92%和21.05%(表2)。這表明生物質(zhì)炭在不同土壤類型中,無(wú)論短期還是長(zhǎng)期作用下均可促進(jìn)團(tuán)聚體的形成和團(tuán)聚體穩(wěn)定性的增加。生物質(zhì)炭農(nóng)田應(yīng)用對(duì)土壤團(tuán)聚體分布的改變與生物質(zhì)炭本身的粒徑大小和結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系[27],由于生物質(zhì)炭巨大的比表面積和各類官能團(tuán),使其具有較強(qiáng)的吸附性能[28- 29],從而在土壤中充當(dāng)了膠結(jié)劑的作用,增加對(duì)粉、黏粒組分的團(tuán)聚作用[30]。其次,生物質(zhì)炭包含從納米到厘米級(jí)的顆粒,在田間大量施用后,小顆粒生物質(zhì)炭可以進(jìn)入團(tuán)聚體內(nèi)部或與礦物結(jié)合態(tài)有機(jī)物結(jié)合[31],增加其膠結(jié)性。而游離的大尺寸生物質(zhì)炭顆粒則對(duì)土壤顆?；蛭F(tuán)聚體進(jìn)行吸附,可進(jìn)一步促進(jìn)了土壤顆粒的團(tuán)聚過(guò)程。另外,生物質(zhì)炭在土壤中可以刺激真菌菌絲的生長(zhǎng),增加土壤顆粒的膠結(jié)作用,從而促進(jìn)其向大團(tuán)聚體的演變。通過(guò)對(duì)團(tuán)聚體進(jìn)行掃描電鏡(SEM)觀察發(fā)現(xiàn)游離的大顆粒生物質(zhì)炭表面附著大量土壤顆粒(圖4),這也成為生物質(zhì)炭促進(jìn)土壤顆粒團(tuán)聚化的直觀證據(jù)。再者,由于生物質(zhì)炭自身極強(qiáng)的抗分解能力,使得以生物質(zhì)炭為核心的團(tuán)聚體的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于以植物凋落物為核心的團(tuán)聚體,這會(huì)大大降低由微生物對(duì)活性有機(jī)組分利用而導(dǎo)致團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)毀壞的可能性[32]。

圖4 生物質(zhì)炭在土壤團(tuán)聚體中的掃描電子顯微鏡圖Fig.4 Scanning electron microscope (SEM) image of biochar in soil aggregates

3.2 生物質(zhì)炭對(duì)土壤微生物豐度和多樣性的影響

土壤微生物多樣性和豐度的增加對(duì)增強(qiáng)水稻土生態(tài)功能的穩(wěn)定和健康具有重要意義[9]。研究表明生物質(zhì)炭施用對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響不盡相同,如Zheng等[9]在中國(guó)西南部酸性水稻土中施用350—550℃的小麥秸稈生物質(zhì)炭(0,20,40 t/hm2)發(fā)現(xiàn),生物質(zhì)炭施用4年后明顯增加了細(xì)菌α-多樣性,同時(shí)降低了真菌的豐度。在本研究中,生物質(zhì)炭處理兩年后同時(shí)提高了土壤中細(xì)菌和真菌的α-多樣性。這表明,生物質(zhì)炭短期添加和長(zhǎng)期存在對(duì)微生物產(chǎn)生的影響可能存在差異。一些室內(nèi)短期培養(yǎng)試驗(yàn)表明生物質(zhì)炭本身的性質(zhì),如pH、孔隙結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成特性等,是影響微生物豐度和多樣性的重要原因[11,33]。而在一些中長(zhǎng)期田間試驗(yàn)中,土壤理化性質(zhì)的改善(降低土壤容重、增加土壤通氣性、提升土壤保水性等)被認(rèn)為是提高微生物豐度和多樣性的重要因素[34- 35]。如最近一些研究發(fā)現(xiàn),田間施用生物質(zhì)炭緩解了作物與微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的競(jìng)爭(zhēng),這一方面是因?yàn)樯镔|(zhì)炭本身攜帶的活性物質(zhì)為微生物提供了豐富的養(yǎng)分和能源,另一方面,由于生物質(zhì)炭施用對(duì)作物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用,間接增加了光合產(chǎn)物由根系向土壤中的輸入[36- 37],從而促進(jìn)了土壤微生物的生長(zhǎng)與繁殖。

微生物群落結(jié)構(gòu)的改變直接影響土壤養(yǎng)分循環(huán)[38]。本研究發(fā)現(xiàn)生物質(zhì)炭施用兩年后的土壤中主要的微生物門水平(變形菌門、酸桿菌門、子囊菌門、擔(dān)子菌門)以及目水平(β-變形桿菌目、粘球菌目、被孢霉目、竹蓋菌目)的相對(duì)豐度均發(fā)生明顯變化,這會(huì)進(jìn)一步影響其在土壤中的功能。就富營(yíng)養(yǎng)型微生物的變形菌門以及對(duì)簡(jiǎn)單碳水化合物利用效率較高的被孢霉目而言,二者通常被認(rèn)為與土壤中活性碳組分的含量呈正相關(guān)關(guān)系[39],而貧養(yǎng)型微生物的酸桿菌門與可溶性有機(jī)碳(DOC)含量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[40]。研究表明施用生物質(zhì)炭不僅增加土壤中的惰性碳組分,同時(shí)也會(huì)提高土壤中DOC等活性碳庫(kù)的含量[41],這可能是本試驗(yàn)中變形菌門和被孢霉目相對(duì)豐度的升高的重要原因。不同土壤利用類型及生物質(zhì)炭原料對(duì)酸桿菌門的影響可能存在差異,如Chen等[12]在旱地土壤中施用350—550℃小麥秸稈生物質(zhì)炭(0,20,40 t/hm2)三年后發(fā)現(xiàn),施炭后酸桿菌門的相對(duì)豐度有所升高；而Li等[42]在中國(guó)紫土中施入玉米秸稈生物質(zhì)炭(500℃)后卻導(dǎo)致酸桿菌門相對(duì)豐度的降低。酸桿菌門主要對(duì)木質(zhì)素,纖維素和半纖維素等有機(jī)物的分解起關(guān)鍵作用[43]。因此,在本試驗(yàn)中酸桿菌門相對(duì)豐度的降低表明施用生物質(zhì)炭有利于植物殘?bào)w在土壤中的積累。真菌對(duì)于穩(wěn)定性較高的碳組分的取食能力以及在高C/N條件下的生存能力高于細(xì)菌[44]。生物質(zhì)炭的施用顯著提升土壤碳氮比的同時(shí)改善土壤通氣狀況,這有利于擔(dān)子菌門的生長(zhǎng)。研究表明,擔(dān)子菌門與高穩(wěn)定性有機(jī)組分(木質(zhì)素,纖維素等)的含量呈正相關(guān)關(guān)系[45]。而生物質(zhì)炭含有的大量芳香性穩(wěn)定有機(jī)物可能會(huì)促進(jìn)擔(dān)子菌門相對(duì)豐度的升高。在本研究中占據(jù)主導(dǎo)地位的子囊菌門是高穩(wěn)定性有機(jī)物降解的主要參與者[42],其相對(duì)豐度顯著降低可能促進(jìn)土壤有機(jī)碳的積累。

3.3 生物質(zhì)炭施用對(duì)水稻土團(tuán)聚體中微生物群落分布的影響

土壤團(tuán)聚體包含大小不同的孔隙和土壤顆粒,能為土壤微生物提供多樣的棲息環(huán)境,從而影響土壤微生物在微域環(huán)境的分布[46]。研究表明,真菌與細(xì)菌的比例在>1.0 mm的團(tuán)聚體中明顯高于<1.0 mm團(tuán)聚體,且土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)受0.05—5.0 mm團(tuán)聚體含量的顯著影響[47]。本次試驗(yàn)的PCA分析表明,無(wú)論是對(duì)細(xì)菌還是真菌,微生物在不同粒組團(tuán)聚體中的分布存在顯著差異。大團(tuán)聚體的酸桿菌門和擔(dān)子菌門,SBR1031和根瘤菌目的相對(duì)豐度明顯高于粉、黏粒組分,而粉、黏粒組分中的硝化螺旋桿菌門、子囊菌門、格孢腔菌目和散囊菌目(Eurotiales)的相對(duì)豐度則高于大團(tuán)聚體。這些差異與土壤團(tuán)聚體形成的微環(huán)境的差異有密切關(guān)系,如不同粒徑團(tuán)聚體中的有機(jī)物化學(xué)組成、C/N、孔隙組成、水分狀況和氧氣含量等生態(tài)因子的多樣化使微生物分布出現(xiàn)明顯異質(zhì)性[48-49]。而生物質(zhì)炭處理相比無(wú)炭土壤,變形菌門、鞭毛菌門、β變形桿菌目、被孢霉目的相對(duì)豐度在大團(tuán)聚體中明顯增加,酸桿菌門、糞殼菌目、厭氧繩菌目的的相對(duì)豐度在微團(tuán)聚體明顯降低。這些結(jié)果表明,生物質(zhì)炭施用在微域環(huán)境中使土壤微生物產(chǎn)生了分異,這些變化可能與以下因素有關(guān)。首先,生物質(zhì)炭通過(guò)膠結(jié)或包裹作用或真菌的菌絲作用增加了土壤的團(tuán)聚作用,改變了原始土壤顆粒的組合方式,從而在空間分布上使微生物群落發(fā)生重新組合和分配；其次,由于生物質(zhì)炭對(duì)土壤的改善作用(如改善通氣性、保水性等),在土壤顆粒重新組合后,相應(yīng)的在土壤微環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)因子也隨之改變,在此情況下,微生物在新環(huán)境中重新適應(yīng),進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)繁殖并改變其結(jié)構(gòu)和組成。由于各粒組微環(huán)境的變化程度并不一致,因而導(dǎo)致在不同團(tuán)聚體粒組中敏感微生物的變異不盡相同。反過(guò)來(lái),這些敏感微生物群落的改變又可能影響所在生境中養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)[30],然而,它們之間的相互作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

(1)水稻土施用生物質(zhì)炭顯著改變了土壤團(tuán)聚體的分布及穩(wěn)定性,主要表現(xiàn)為大團(tuán)聚體含量的增加與穩(wěn)定性的提高。

(2)施用生物質(zhì)炭顯著改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。與對(duì)照相比,生物質(zhì)炭施用下全土中細(xì)菌和真菌的多樣性顯著增加。在門水平上,變形菌門、硝化螺旋桿菌門和擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度明顯升高,而子囊菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門的相對(duì)豐度明顯下降；在目水平上,β-變形桿菌目、竹蓋菌目和被孢霉目的相對(duì)豐度明顯升高,而糞殼菌目、厭氧繩菌目和溶菌目的相對(duì)豐度明顯下降。

(3)不同粒徑團(tuán)聚體中微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。大團(tuán)聚體中酸桿菌門、擔(dān)子菌門、根瘤菌目的相對(duì)豐度明顯高于其他粒組,而硝化螺旋桿菌門、子囊菌門、β-變形桿菌目呈相反趨勢(shì)。施用生物質(zhì)炭顯著改變了不同粒組中微生物群落分布。與未施用生物質(zhì)炭相比,生物質(zhì)炭施用顯著增加了大團(tuán)聚體中變形菌門、鞭毛菌門、竹蓋菌目、β-變形桿菌目以及粉、黏粒組中的擔(dān)子菌門、球囊菌門、格孢腔菌目的相對(duì)豐度,降低了微團(tuán)聚體中酸桿菌門、放線菌門、子囊菌門、糞殼菌目以及粉、黏粒組分中芽單胞菌門、子囊菌門和厭氧繩菌目的相對(duì)豐度。