劉 靜，曹書(shū)華，趙 喜，楊云琳，寧方玲 (.濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 56603；.德州市第二人民醫(yī)院，山東 德州 53005)

肺癌無(wú)論是發(fā)病率還是死亡率，歷年來(lái)都高居惡性腫瘤的首位。在肺癌的發(fā)病占比中，小細(xì)胞肺癌總體數(shù)量穩(wěn)定，但非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病比例仍有上升趨勢(shì)，且疾病譜也不斷發(fā)生變化。相對(duì)于既往鱗癌占多數(shù)，最新的數(shù)據(jù)顯示腺癌所占比例呈快速上升[1]。雖然靶向治療為部分非小細(xì)胞肺癌的治療提供了新的治療選擇，但仍有很大一部分患者療效欠佳。 因此，明確非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，選擇新的治療靶點(diǎn)成為目前臨床的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 1 (Neureg-ulin-1, NRG-1)是NRG基因家族成員之一，又稱神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(GGF1)，它是從牛垂體中純化而得到的[2-4]。在結(jié)構(gòu)上從屬于表皮生長(zhǎng)因子家族(EGFR)。最早發(fā)現(xiàn)分布于發(fā)育中的心室內(nèi)膜，不表達(dá)于大的動(dòng)靜脈及主動(dòng)脈，只在心內(nèi)膜和心肌微血管中表達(dá)[6]。近些年國(guó)外相關(guān)研究顯示， NRG-1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且其發(fā)生作用的過(guò)程中導(dǎo)致多種與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路分子改變[7]。但其在肺癌中是否也存在表達(dá)異常尚未得到很好的探索。在本研究中，筆者回顧性分析了我院在2013年1月1日～2014年12月31日行肺癌根治術(shù)的患者，探討NRG-1在肺癌中的表達(dá)及與下游信號(hào)通道蛋白PI3K的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料：在本研究中，收集2010年1月1日～2013年12月31日于德州市第二人民醫(yī)院行肺癌根治術(shù)的患者石蠟標(biāo)本，總計(jì)132例，分析病變組織及癌旁組織免疫組化表達(dá)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌，且術(shù)前未行新輔助放化療，隨訪資料完整。全組患者年齡32～76歲，平均(53.13±14.47)歲，根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟手術(shù)病理分期，全組分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期；其中腺癌70例，鱗癌62例。

1.2主要試劑及儀器：兔抗人NRG-1單克隆抗體、PI3K單克隆抗體及免疫組化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3免疫組化染色及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：免疫組化具體過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0～10%為0分，>10%～25%為1分，>25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)著色為0分，微弱著色為1分，中等強(qiáng)度著色為2分，強(qiáng)著色為3分。將以上兩組結(jié)果相乘，得出評(píng)估范圍為0～12分，0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為(++)，5～12分為(+++)。(-)～(+)為低表達(dá)，(++～+++)為高表達(dá)。

1.4預(yù)后隨訪：主要采用電話隨訪方式，主要觀察指標(biāo)為總存活時(shí)間(Overall Survival，OS)，隨訪截止日期2018年12月31日。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)，Kaplan-Meier生存分析描繪生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較不同組之間生存差異；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NRG-1、PI3K在肺癌中的表達(dá)：經(jīng)免疫組化檢測(cè)，NRG-1和PI3K陽(yáng)性表達(dá)主要著色于細(xì)胞漿，部分表達(dá)于細(xì)胞膜。NRG-1在癌組織中陰性表達(dá)46例，弱陽(yáng)性43例，中度陽(yáng)性26例，強(qiáng)陽(yáng)性17例，高表達(dá)率32.6%(43/132)；癌旁組織陰性表達(dá)21例，弱陽(yáng)性40例，中度陽(yáng)性39例，強(qiáng)陽(yáng)性32例，高表達(dá)率為53.8%(71/132)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.104，P=0.001)。PI3K在癌組織中陰性表達(dá)30例，弱陽(yáng)性33例，中度陽(yáng)性27例，強(qiáng)陽(yáng)性42例，高表達(dá)率為52.3%(69/132)；癌旁組織陰性表達(dá)51例，弱陽(yáng)性46例，中度陽(yáng)性18例，強(qiáng)陽(yáng)性17例，高表達(dá)率為26.5%(35/132)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.340，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

A：NRG-1在非小細(xì)胞肺癌中陽(yáng)性表達(dá)；B：PI3K在非小細(xì)胞肺癌中陽(yáng)性表達(dá)

2.2NRG-1、PI3K與肺癌臨床病理因素的相關(guān)性：NRG-1表達(dá)在不同分期、病理分級(jí)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在不同年齡、性別、病理類型間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而PI3K表達(dá)僅在不同分期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NRG-1、PI3K和肺癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

臨床特征NRG-1表達(dá)高表達(dá)低表達(dá)P值PI3K表達(dá)高表達(dá)低表達(dá)P值年齡≤60歲20390.77126330.090>60歲23504330性別男30610.88643480.085女13282615TNM分期Ⅰ期8120.0156140.018Ⅱ期22312528Ⅲ期13563821病理類型腺癌25420.23834330.721鱗癌18473530病理分級(jí)高分化790.0446100.437中分化25373329低分化11433024

2.3NRG-1與PI3K表達(dá)的相關(guān)性研究：為進(jìn)一步明確NRG-1與PI3K表達(dá)之間的相關(guān)性，采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)分析二者在132例肺癌患者的表達(dá)之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示NRG-1與PI3K表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.407，P=0.012)。見(jiàn)表2。

2.4NRG-1、PI3K表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系：至隨訪截止，全組患者隨訪時(shí)間7～86個(gè)月，平均生存時(shí)間(41.3 ±17.4)個(gè)月， 1 年生存率為93.6 %， 3 年生存率為61.3 %，5年生存率31.6 %。根據(jù)NRG-1、PI3K表達(dá)將肺癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，通過(guò)Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較并繪制Kaplan-Meier曲線(見(jiàn)圖2、3)。結(jié)果顯示：NRG-1低表達(dá)組OS明顯差于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.224,P=0.022)；PI3K低表達(dá)組OS明顯優(yōu)于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.786,P=0.005)。

表2 NRG-1與PI3K之間的相關(guān)性(例)

NRG-1表達(dá)PI3K表達(dá)-++++++r值P值-4131019-0.4070.012+591019++13742+++8432

圖2 NRG-1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者OS的關(guān)系

圖3 PI3K表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者OS的關(guān)系

3 討論

非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展是多病因、多步驟的過(guò)程，它的病因是極其復(fù)雜的， 受到多種基因的調(diào)控，其中抑癌基因的失活和癌基因的激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。NRG-1能夠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞分化的機(jī)制已經(jīng)開(kāi)始研究，并且發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)分化的過(guò)程中microRNA作為干細(xì)胞向細(xì)胞分化的中間介質(zhì)，在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同劑量NRG-1在不同時(shí)間干預(yù)干細(xì)胞的分化后會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果[8,9]，最早有報(bào)道說(shuō)NRG-1可以增加鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，但不具有特異性[10]。除此之外，NRG-1還被發(fā)現(xiàn)參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。在人的食管癌中發(fā)現(xiàn)NRG-1的表達(dá)水平降低[11]。提示其可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌作用。

在本研究中，通過(guò)回顧性分析非小細(xì)胞肺癌患者病理標(biāo)本的NRG-1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)降低，并且和腫瘤的分期、組織分化有關(guān)，提示其參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并且與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。為進(jìn)一步明確NRG-1發(fā)揮作用的機(jī)制，筆者同時(shí)研究了EGFR下游信號(hào)通路蛋白PI3K的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PI3K在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，二者相關(guān)性分析顯示呈明顯負(fù)相關(guān)，提示NRG-1有可能通過(guò)PI3K途徑對(duì)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程發(fā)揮作用。

綜上所述，本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NRG-1在非細(xì)胞肺癌中表達(dá)降低，并可能通過(guò)PI3K途徑發(fā)揮作用，提示NRG-1可能是非小細(xì)胞肺癌的抑癌基因，可作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后判斷的指標(biāo)之一，有望成為新的治療靶點(diǎn)。