于建軍

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

帕金森病(PD)是一種與遺傳、環(huán)境、神經(jīng)系統(tǒng)老化等因素相關(guān)的常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病。臨床表現(xiàn)有靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)平衡障礙等特征性運(yùn)動(dòng)癥狀，亦有精神障礙、便秘、嗅覺(jué)障礙、睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)伴隨癥狀。其中精神障礙中的抑郁癥狀對(duì)患者生活質(zhì)量的影響比運(yùn)動(dòng)障礙更為嚴(yán)重。目前普遍認(rèn)為40%～50%的PD患者合并抑郁[1]。抑郁癥狀會(huì)影響患者的治療效果，加重患者運(yùn)動(dòng)障礙，加重殘疾率,降低生活質(zhì)量。但帕金森抑郁(PDD)與原發(fā)性抑郁的發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、對(duì)抗抑郁藥的反應(yīng)不完全相同。PDD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主流認(rèn)為與內(nèi)源性生物學(xué)改變及外源性環(huán)境因素有關(guān)。本研究觀察電針刺激法對(duì)PDD模型大鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)含量的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠120只，雌雄不拘，大鼠平均體質(zhì)量為(258.12±36.14)g，購(gòu)入后在實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)7天(保證每天12 h光照以及大鼠的正常飲水與攝食，保持清潔的飼養(yǎng)環(huán)境)，待大鼠適應(yīng)新環(huán)境、狀態(tài)佳后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器及試劑

DA放免試劑盒、5-HT放免試劑盒、NE放免試劑盒(解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所)；0.25 mm×25 mm針灸針(貴州安迪藥械有限公司,安迪牌)；G6805-2A型電針治療儀(上海華誼儀器制造廠)。

1.3 造模方法

1.3.1 PD大鼠造模方法 對(duì)56只大鼠進(jìn)行編號(hào)，隨機(jī)抽出12只做為空白組，剩余的44只均用于造模實(shí)驗(yàn)。對(duì)造模組大鼠稱體重計(jì)算麻醉藥用量，采用常規(guī)方法麻醉，大鼠麻醉成功后利用腦立體定位儀獲取大鼠腦立體定向圖譜，確定大腦黑質(zhì)區(qū)位置后，鉆開(kāi)顱骨，注射器確定靶向位后緩慢注射6-羥基多巴胺(6-OHDA)。在術(shù)后2周，在大鼠腹腔注射阿撲嗎啡誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)，計(jì)數(shù)40 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。記錄大鼠5 min向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)以及在40 min之內(nèi)發(fā)生旋轉(zhuǎn)的總次數(shù)[2]。而后對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算處理，每分鐘向健側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于7圈，且在40 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于280圈的大鼠認(rèn)為是陽(yáng)性大鼠，連續(xù)4周進(jìn)行統(tǒng)分析，每周結(jié)果均符合上述要求的大鼠即為PD模型鼠。在本次造模試驗(yàn)中44只大鼠中共36只大鼠造模成功。

1.3.2 PDD模型制作 待PD模型造模成功后，隨機(jī)抽出12只做為6-OHDA模型組，其余24只大鼠利用改進(jìn)版的Winner慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激法結(jié)合孤養(yǎng)法制造大鼠抑郁模型[3]。首先將用于造模的實(shí)驗(yàn)大鼠單獨(dú)1個(gè)鼠籠飼養(yǎng)，而后通過(guò)不定順序的刺激導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)應(yīng)激障礙，其刺激條件包括全天禁食、全天禁水、4℃冷水游泳、懸尾、晝夜顛倒、行為限制以及電擊足底7種應(yīng)激刺激，整個(gè)刺激周期為21天，每種刺激出現(xiàn)3～4次，但是保證1個(gè)刺激不能連續(xù)出現(xiàn)兩天，觀察大鼠的行為學(xué)變化并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4 分組與處理方法

56只大鼠中隨機(jī)抽出12只做為空白組，在第1次造模成功的36只大鼠中隨機(jī)抽出12只做為6-OHDA模型組，將2次造模的24只大鼠分為2組:6-OHDA抑郁模型組12只、電針組12只。

電針組選用“百會(huì)”“印堂”“太沖”“三陰交”穴。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜定位，“百會(huì)”透刺“印堂”穴，“印堂”穴向下平刺，“太沖”“三陰交”直刺進(jìn)針，深度為8～10 mm，“百會(huì)”與“印堂”“太沖”與“三陰交”接G-66805型電針治療儀，設(shè)置電流強(qiáng)度為0.6 mA，頻率為2 Hz，待大鼠頭部和腳趾發(fā)生微顫定為針刺程度上限，電針時(shí)間為40 min，每日1次。治療周期為8周，從第5周開(kāi)始觀察大鼠的行為學(xué)變化。其余3組不給予任何處置。

1.5 觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)方法

1.5.1 動(dòng)物行為學(xué)觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)方法 評(píng)價(jià)方法主要包括懸尾試驗(yàn)、糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)以及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。其具體的評(píng)價(jià)方法[4]為:①懸尾試驗(yàn)(Tail suspension test,TST)：大鼠尾巴固定于懸空橫桿上，保持大鼠與地面1.5 m高度，統(tǒng)計(jì)大鼠在每5 min內(nèi)的靜止時(shí)間，大鼠四肢與頭部相對(duì)不動(dòng)，整個(gè)身體晃動(dòng)的時(shí)間劃分到靜止時(shí)間。②糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)(Sucrose preference test,SPT)：大鼠分籠后，在每個(gè)鼠籠中放置兩個(gè)飲水裝置，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1天，在兩個(gè)容器中均放入含量為1%的蔗糖溶液，在實(shí)驗(yàn)第2天，將其中1個(gè)容器中的蔗糖水更換成純凈水。而后禁食水1天，開(kāi)始糖水消耗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，同時(shí)給予大鼠等量的1%的蔗糖溶液以及純凈水，正常飼喂24 h后，計(jì)算糖水的消耗量，從而確定大鼠的糖水偏愛(ài)率，其計(jì)算公式為：糖水偏愛(ài)率=糖水消耗/綜合體消耗×100%。③強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(Forced swimming test,FST)：在透明的玻璃缸中放置溫度23～25℃的溫水，放入實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，游泳時(shí)長(zhǎng)為6 min，前兩分鐘由于大鼠剛接觸水環(huán)境的一系列應(yīng)激性行為不計(jì)入統(tǒng)計(jì)，記錄后4 min大鼠漂浮不動(dòng)的時(shí)間，大鼠靜止時(shí)間越長(zhǎng)說(shuō)明抑郁程度越大。在每只大鼠完成試驗(yàn)后要對(duì)實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行統(tǒng)一的清理，避免影響下一只大鼠的檢測(cè)結(jié)果。

1.5.2 神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)方法 大鼠行為學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)完成后，將大鼠麻醉處死，快速取出大鼠腦組織，將其進(jìn)行保存。適時(shí)取冷凍保存的腦組織，制備腦組織勻漿樣本，4℃13 000 r/min 離心處理20 min后取上清液利用放射免疫測(cè)定方法檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)比較

與空白組比較，6-OHDA抑郁模型組大鼠的懸尾靜止時(shí)間與懸浮不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，糖水消耗率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明6-OHDA抑郁模型組大鼠出現(xiàn)了行動(dòng)緩慢、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡等抑郁表現(xiàn)。6-OHDA抑郁模型組與6-OHDA模型組各指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。電針組與6-OHDA抑郁模型組相比，大鼠懸尾靜止時(shí)間及懸浮不動(dòng)時(shí)間縮短，糖水消耗率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明電針對(duì)帕金森抑郁大鼠的行為學(xué)有良好的改善作用。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)比較

注：與空白組比較，△P<0.05；與6-OHDA模型組比較，*P>0.05；與6-OHDA抑郁模型組比較，#P<0.05。

2.2 大鼠腦內(nèi)DA含量變化

與空白組比較，6-OHDA模型組與6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內(nèi)DA含量均顯著降低(P<0.05)，結(jié)合行為學(xué)表現(xiàn)說(shuō)明帕金森模型造模成功。6-OHDA模型組與6-OHDA抑郁模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。電針組與6-OHDA抑郁模型組比較，大鼠腦組織中DA含量升高，經(jīng)檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明電針可使帕金森抑郁模型大鼠腦內(nèi)的多巴胺含量升高。見(jiàn)表2。

表2 大鼠腦內(nèi)DA含量變化

注：與空白組比較，△P<0.05；與6-OHDA模型組比較，*P>0.05；與6-OHDA抑郁模型組比較，#P<0.05。

2.3 大鼠腦內(nèi)5-HT與NE含量變化

與空白組比較， 6-OHDA模型組、6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內(nèi)5-HT與NE含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與6-OHDA模型組比較，6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內(nèi)5-HT與NE含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明帕金森抑郁與5-HT與NE含量降低有相關(guān)性。與6-OHDA抑郁模型組比較，電針組大鼠腦組織中5-HT與NE含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明電針?lè)梢蕴岣吲两鹕∫钟舸笫竽X5-HT與NE的含量。見(jiàn)表3。

表3 大鼠腦內(nèi)5-HT與NE含量變化

注：與空白組比較，△P<0.05；與6-OHDA模型組比較，*P<0.05；與6-OHDA抑郁模型組比較，#P<0.05。

3 討論

PDD是PD患者常伴發(fā)的非運(yùn)動(dòng)癥狀,以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，有悶悶不樂(lè)、悲痛欲絕、自卑、悲觀厭世等情緒癥狀，嚴(yán)重者有幻覺(jué)、妄想等精神癥狀，因此可出現(xiàn)思維遲緩、缺乏主動(dòng)性等表現(xiàn)。本研究的研究對(duì)象為無(wú)溝通能力的大鼠，因此無(wú)法表達(dá)自己的情緒與精神狀態(tài)，選擇慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激(CUMS)法造模，因?yàn)榇碳さ牟豢深A(yù)見(jiàn)性和多變性使之比較現(xiàn)實(shí)的模擬人在生活中所遭遇的各種困難。并且經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期多變和不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激之后，大鼠糖水消耗量的減少反映了抑郁的核心癥狀——對(duì)獎(jiǎng)賞的反應(yīng)性下降，即快感缺失[5]。模型引發(fā)的抑郁樣行為可持續(xù)數(shù)月,長(zhǎng)期服用抗抑郁藥物可糾正并改善這些異常行為,是目前使用最為廣泛的模型[6]。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)屬于中樞神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)神經(jīng)、內(nèi)分泌等系統(tǒng)有非常廣泛的調(diào)節(jié)作用，并對(duì)情感、情緒、應(yīng)激行為等生理活動(dòng)產(chǎn)生重要影響。其主要包括5-羥色胺(serotonin，5-HT)和兒茶酚胺(CA)。兒茶酚胺主要指多巴胺(Dopandne，DA)、腎上腺素(Adrenaline，A)和去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)[7]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，5-HT、NE、DA 之間聯(lián)系緊密并且相互作用，三者的平衡失調(diào)是引起抑郁癥的重要原因[8]。5-HT是臨床上目前治療抑郁癥的重要靶向因子。腦內(nèi)5-HT系統(tǒng)的功能異常與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)[9]。NE具有調(diào)節(jié)機(jī)體情緒、認(rèn)知等生理功能。有研究表明NE通過(guò)去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體(Norepinephrine transporter，NET)的微調(diào)而發(fā)揮作用，在抑郁癥的發(fā)病中可能起著重要作用[10]。DA 作為NE的前體，參與心理應(yīng)激活動(dòng)及精神情緒活動(dòng)，腦內(nèi)DA含量降低時(shí)就會(huì)出現(xiàn)情緒抑郁。

PDD在中醫(yī)理論中屬于“顫證”“郁證”合病的一種疾病類型，該病肝腎陰虧為本，風(fēng)、火、痰、瘀為標(biāo)，導(dǎo)致髓?？仗摗鈾C(jī)郁滯，是本病產(chǎn)生的根本原因。王順教授通過(guò)30年針灸臨床與科研實(shí)踐，獨(dú)出機(jī)杼地提出“調(diào)神暢情三六九針?lè)ā盵11-15]。調(diào)神暢情最早見(jiàn)于《北堂書(shū)鈔·卷一四二》曰:“安慮潤(rùn)氣，調(diào)神暢情”，但書(shū)中未有詳載。王教授解釋為使精神順適、情緒歡暢。因在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，考慮到針刺部位存在的局限性，故在“調(diào)神暢情三六九針?lè)ā敝羞x取典型代表穴位進(jìn)行針刺，百會(huì)為諸經(jīng)交會(huì)之要穴，又為督脈之大穴，“督脈入絡(luò)腦”與腦關(guān)系密切，所以人體之精氣可以通過(guò)百會(huì)散絡(luò)于腦。調(diào)節(jié)百會(huì)穴，可奉養(yǎng)元神，有健腦益髓、益心安神之功。印堂穴位于腦海前庭，為經(jīng)外奇穴，有安神定驚、醒腦開(kāi)竅、寧心益智、疏風(fēng)止痛、通經(jīng)活絡(luò)之功。太沖為足厥陰肝經(jīng)輸穴、原穴，具有疏肝理氣、通經(jīng)活絡(luò)、平肝熄風(fēng)、清熱利濕之效。三陰交為足太陰脾經(jīng)腧穴，為肝脾腎三經(jīng)的交會(huì)穴，有補(bǔ)脾益腎調(diào)肝之功效。四穴相配，標(biāo)本兼治，加強(qiáng)了醒神復(fù)常、健腦寧心、安神定志的功效。

本研究結(jié)果證實(shí)，與空白組大鼠相比,6-OHDA模型組與6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內(nèi)DA含量均顯著降低(P<0.05)，結(jié)合行為學(xué)表現(xiàn)說(shuō)明PD模型造模成功。6-OHDA抑郁模型組大鼠出現(xiàn)了行動(dòng)遲緩、對(duì)事物興趣下降等變化，但電針刺激后，其懸尾靜止時(shí)間以及強(qiáng)迫游泳懸浮時(shí)間顯著縮短，且糖水消耗率升高，說(shuō)明電針?lè)軌蛴行У木徑獯笫笠钟粝嚓P(guān)的行為學(xué)活動(dòng)。與空白組、6-OHDA模型組相比，6-OHDA抑郁模型組大鼠腦內(nèi)5-HT與NE含量均顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明PDD與5-HT和NE含量降低有相關(guān)性。這一結(jié)果與之前相關(guān)研究所證實(shí)的抑郁癥發(fā)病與5-HT以及NE等神經(jīng)遞質(zhì)的含量異常之間存在緊密聯(lián)系[16]的結(jié)果相符合。與6-OHDA抑郁模型組相比電針組大鼠腦組織中5-HT與NE含量升高，說(shuō)明電針?lè)梢蕴岣逷DD大鼠腦內(nèi)5-HT與NE的含量。

綜上，電針可使PD大鼠腦內(nèi)DA含量顯著升高、PDD大鼠腦內(nèi)5-HT與NE水平明顯升高，從而改善抑郁癥狀，值得在臨床中推廣。