張國林，李 倩，王正平

(蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215000)

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及儀器

LA2-4A1型生物安全柜、AVC-6D1型超凈工作臺購自新加坡Esco公司；Sciencific 815型培養(yǎng)箱購自美國賽默飛世爾公司；KB240型培養(yǎng)箱購自德國Binder公司；PL602-L型電子天平、FE20型pH計購自瑞士梅特勒-托利多集團；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：20170629)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號：20190313)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號：20180626)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂(批號：20160728)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(批號：20180236)購自青島海博生物技術有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號：180113)購自北京陸橋技術股份有限公司；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號：20190419)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：1070921)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(批號：1702162)購自北京三藥科技開發(fā)公司；RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基(批號：709895)購自BD公司。培養(yǎng)基適用性檢查及檢測方法驗證用菌株見表1。

表1 培養(yǎng)基適用性檢查及檢測方法驗證用菌株

1.2 大黃蟲丸處方及制法

處方：熟大黃300 g，土鱉蟲(炒)30 g，水蛭(制)60 g，虻蟲(去翅足，炒)45 g，蠐螬(炒)45 g，干漆(煅)30 g，桃仁120 g，炒苦杏仁120 g，黃芩60 g，地黃300 g，白芍120 g，甘草90 g。制法：以上12味粉碎成最細粉，過篩，混勻，用水泛丸，干燥，打光，制成水丸。以上12味粉碎成細粉，過篩，混勻，每100 g粉末用煉蜜30～45 g加適量水泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加煉蜜80～100 g制成小蜜丸或大蜜丸。

1.3 微生物限度檢查方法[6]

參照2015年版《中國藥典》非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法<1105><1106>和企業(yè)標準，建立并驗證微生物計數(shù)和控制菌檢查方法。需氧菌總數(shù)檢查采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 ml/皿)，霉菌和酵母菌總數(shù)、控制菌檢查均采用常規(guī)法進行。

1.3.1供試液制備

從至少2個獨立包裝中稱取供試品12 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至120 ml，45℃水浴中保溫振蕩，使供試品分散均勻，作為1∶10的供試液。

1.3.2大腸埃希菌檢查

取1∶10的供試液10 ml接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；取預培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物劃線于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.3.3耐膽鹽革蘭陰性菌定量檢查

取1∶10的供試液21 ℃條件下放置約2 h，取相當于0.1、0.01、0.001 g供試品的預培養(yǎng)物或其稀釋液(取1∶10的供試液 ml接種至9 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中混勻，作為1∶100供試液；取1∶100的供試液1 ml接種至9 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中混勻，作為1∶1000供試液)分別接種至10 ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，32℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.3.4沙門菌檢查

取10 g 供試品接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物0.1 ml接種至10 ml RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.3.5需氧菌總數(shù)檢查

取1∶10供試液2 ml接種至10個平皿，每皿0.2 ml；1∶100供試液(取1∶10供試液1 ml接種至9 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中混勻，作為1∶100供試液)1 ml接種至2個平皿，每皿1 ml。注入20 ml左右融化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，倒置培養(yǎng)。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基代替供試液作為陰性對照。

1.3.6霉菌和酵母菌數(shù)檢查

取1∶10供試液2 ml接種至2個平皿，每皿1 ml。每皿注入20 ml左右融化的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，倒置培養(yǎng)。稀釋液代替供試液作為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用Excel進行結果統(tǒng)計。計數(shù)資料采用百分比(%)表示。

2 結果

2.1 大黃蟲丸來源分布

表2 大黃蟲丸來源分布 批(%)

2.2 微生物限度結果

表3 微生物限度結果

3 討論

微生物限度檢查是中藥制劑質(zhì)量控制的重要方面，也是保障制劑安全的重要措施[7]。大黃蟲丸是由12味藥材制成的中藥制劑，各成分均為藥材原粉入藥，具有很高的微生物污染風險。本研究通過對全國13家藥品生產(chǎn)企業(yè)的190批大黃蟲丸進行檢查，發(fā)現(xiàn)不同批次和廠家制劑的微生物數(shù)量存在較大的差異性。其中大部分樣品的需氧菌總數(shù)<1×101cfu/g，但也有2批的需氧菌總數(shù)≥103cfu/g，需引起注意。霉菌和酵母菌總數(shù)方面，大部分樣品的計數(shù)結果<1×101cfu/g，但有16批的計數(shù)結果≥101cfu/g。

已有報道提出中藥飲片的微生物污染較為嚴重，且耐熱菌和耐膽鹽革蘭陰性菌的污染率高[8]。此外，中藥飲片中沙門菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌等控制菌的檢出率較高[9]。雖然不同于中藥飲片，但大黃蟲丸有12味藥材原粉入藥，其中4味為動物藥，可能造成微生物污染的風險較大。但本研究發(fā)現(xiàn)190批大黃蟲丸樣品均未檢出控制菌(僅個別樣品在選擇性平板上有菌落生長)，而且需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)2個指標結果均較好?；跈z驗結果推斷，可能是生產(chǎn)企業(yè)較好地控制了原材料的微生物限度以及生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，也可能是采用了某種形式的終端滅菌方法。

中藥制劑中抑菌成分的存在會影響檢查的結果。黃芩和大黃均為具有較強抑菌活性的中藥，對常見的致病菌均具有抑菌作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)黃芩、大黃等對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等有抗菌作用[12]，且含有黃芩成分的外用制劑的微生物限度檢查需采用培養(yǎng)基稀釋法[13]。本研究也證實大黃蟲丸在檢查需氧菌總數(shù)時應采用培養(yǎng)基稀釋法，但霉菌和酵母菌總數(shù)檢查可采用常規(guī)法。