萬慧穎，徐敏燕，李芳華，胥 穎，謝 震

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所，四川 成都 610031；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院病理科，四川 成都 610072)

侵襲性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)是指侵襲深部組織的真菌感染，其臨床診斷有時(shí)很困難，并且對(duì)侵襲性真菌感染患病率趨勢的準(zhǔn)確評(píng)估是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。Shimodaira[1]對(duì)日本Toho大學(xué)1955～2006年所有記錄的真菌感染病例進(jìn)行了尸檢記錄的回顧性檢查。在10297例尸檢中共檢出411例IFI。其中曲霉菌病的患病率在52年期間增加，達(dá)到2.0%。近年來，隨著各種先進(jìn)的診療手段的運(yùn)用，如干細(xì)胞和器官移植、惡性腫瘤的化療和分子靶向治療、廣譜抗生素的廣泛使用等，以及在獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)的患者中，IFI的發(fā)生率呈上升趨勢。

直接從活檢病理組織切片中檢測到真菌感染是重要的診斷方法，但是常規(guī)HE染色、PAS染色和六胺銀染色均存在一定的局限性。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是一種采用非放射性熒光物質(zhì)標(biāo)記種屬特異性的探針，在待檢測的細(xì)胞核或染色體中顯示DNA序列具體位置的方法。本研究選擇針對(duì)曲霉菌屬18SrRNA的寡核苷酸通用探針，利用FISH技術(shù)檢測石蠟包埋組織中的曲霉菌，初步探討其在臨床早期診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性收集四川省人民醫(yī)院2010年1月至2018年12月經(jīng)病理檢查疑診為曲菌感染的50例石蠟包埋存檔標(biāo)本。其中疑診鼻腔鼻竇曲霉感染34例、支氣管肺曲霉感染14例、皮膚曲霉感染2例。另設(shè)陽性對(duì)照組(經(jīng)真菌培養(yǎng)已確診為曲霉感染)、陰性對(duì)照組(經(jīng)真菌培養(yǎng)已確診為念珠菌感染)和空白對(duì)照組(不加探針)各10例。每份石蠟標(biāo)本連續(xù)切片5張，分別做常規(guī)HE、PAS染色、六胺銀染色、真菌熒光染色及FISH檢測。

1.2 方法

1.2.1常規(guī)HE、PAS染色及六胺銀染色 組織石蠟切片按照本院病理科染色方法進(jìn)行常規(guī)HE、PAS染色及六胺銀染色。

1.2.2真菌熒光染色 將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，然后依次放入100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中，晾干后滴加真菌熒光染色液一滴，10% KOH一滴，混勻。輕輕加蓋干凈蓋玻片一張，放置1 min后，在熒光顯微鏡下觀察[2]。

1.2.3探針制備 參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)寡核苷酸探針18S-1，此探針以曲霉菌(Aspergillus)的18SrRNA作為靶序列，5′-端用6-FAM熒光標(biāo)記。探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列為：5′-GCGGGTCATCATAGAAACACCGC-3′，長度為23個(gè)堿基。

1.2.4FISH檢測 ①脫蠟：將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，共3次，每次10 min，然后放入100%乙醇中脫蠟2次，85%乙醇及70%乙醇各脫臘1次，每次均為3 min；②消化：將蛋白酶K工作液滴加在組織切片上，于37 ℃下消化30 min，然后逐級(jí)移入70%乙醇、80%乙醇及100%乙醇內(nèi)脫水，各2 min，空氣干燥；③雜交：準(zhǔn)備探針，滴加適量在組織上，壓緊蓋玻片后，用膠水密封，放入雜交儀中，37 ℃條件下雜交過夜；④洗滌：雜交結(jié)束后，去除膠水和蓋玻片，常溫下2×SSC洗滌液中洗滌2次，每次5 min。然后在梯度乙醇中脫水，空氣干燥；⑤復(fù)染：在雜交區(qū)加入DAPI復(fù)染液，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察并分析結(jié)果。自步驟③開始均需避光操作。陽性、陰性和空白對(duì)照組同上述方法作FISH檢測。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)HE、PAS染色及六胺銀染色44例標(biāo)本在常規(guī)HE染色下均可以見到具有分隔的菌絲，菌絲粗細(xì)、長短不一，部分菌絲可見角叉狀分枝，分枝間約呈45°夾角(圖1)，形態(tài)學(xué)上考慮為曲霉感染。50例標(biāo)本在PAS染色及六胺銀染色下均可以見到具有分隔的菌絲及45°角叉狀分枝，染色后分別呈品紅色和棕黑色 (圖2和圖3)，部分菌絲粗大且分隔不明顯，形態(tài)學(xué)上難以完全與毛霉相鑒別。

圖1 HE染色 可見具有分隔的菌絲，菌絲分枝約呈45°角(HE，× 400)

圖2 PAS染色 可見品紅色分隔菌絲，有45°角叉狀分枝(PAS，×400)

2.2 真菌熒光染色46例真菌熒光染色的切片鏡下均顯示亮藍(lán)色具有分隔的菌絲，可見清晰的菌絲輪廓，部分菌絲可見45°角叉狀分枝 (圖4)。

2.3 FISH檢測采用18S-1寡核苷酸探針檢測50例石蠟包埋標(biāo)本，其中有32例呈陽性反應(yīng)。菌絲壁和菌絲內(nèi)可見大量綠色顆粒狀熒光，部分顆粒狀熒光排列成分枝狀，雜交信號(hào)較強(qiáng)，容易判斷，可以確定為曲霉菌(圖5)。用18S-1寡核苷酸探針與陽性對(duì)照組(已確診為曲霉感染)進(jìn)行FISH，也可見綠色顆粒狀的陽性雜交信號(hào)。與陰性對(duì)照組(念珠菌感染)進(jìn)行FISH，呈陰性結(jié)果，未見綠色的雜交信號(hào)。空白對(duì)照組結(jié)果亦為陰性。

圖5 熒光原位雜交 顯示菌絲壁和菌絲內(nèi)可見綠色顆粒狀熒光，部分排列成分枝狀(FISH，×400)

2.4 五種檢測方法對(duì)比HE染色、PAS染色、六胺銀染色、真菌熒光染色和FISH檢測5種方法檢測石蠟包埋組織中真菌感染，其結(jié)果對(duì)比見表1。

表1 5種方法檢測石蠟包埋組織中真菌感染的結(jié)果 (例)

3 討論

臨床上深部真菌感染的早期診斷比較困難，導(dǎo)致很多患者病情延誤。常規(guī)組織病理是采用直接鏡檢觀察真菌的形態(tài)來診斷，但是許多真菌在組織中的形態(tài)相似，并且其形態(tài)會(huì)受多種因素的影響，故難以確定其種屬。從臨床或病理標(biāo)本中培養(yǎng)真菌，所需時(shí)間一般為2周或更長，且深部真菌感染的病原菌常不易培養(yǎng)成功。如何準(zhǔn)確地鑒定深部真菌感染的病原菌，已成為國內(nèi)外學(xué)者探索的重要課題。

原位雜交技術(shù)(ISH)是指用已知標(biāo)記的DNA或RNA探針，按照核酸雜交中的堿基配對(duì)原則，借助免疫組化技術(shù)在待測組織細(xì)胞內(nèi)顯示出目的基因的方法，目前已在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用。馬蕾[4]將煙曲霉高度特異的堿性蛋白酶基因片段設(shè)計(jì)為種特異性探針，5′-端標(biāo)記地高辛，檢測出臨床常見的煙曲霉和黃曲霉的感染。Hanazawa[5]采用原位雜交技術(shù)檢測，結(jié)果證明用568-bp探針可以在感染中特異性檢測到煙曲霉，該技術(shù)可適用于臨床用于分子診斷煙曲霉感染的標(biāo)本。

FISH是在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，用熒光標(biāo)記探針后檢測，是一種非放射性的、對(duì)環(huán)境不構(gòu)成污染的技術(shù)。由于可以同時(shí)使用多個(gè)探針并進(jìn)行多色觀察分析，因此大大縮短了檢測周期并使過程簡化，可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)以曲霉菌的18SrRNA作為靶序列，參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了寡核苷酸探針18S-1.18S-1探針與煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉和灰綠曲霉等具有90%～100%的同源性，可以特異性地鑒定出臨床絕大部分的致病曲霉菌，可協(xié)助臨床進(jìn)行迅速、準(zhǔn)確的判斷[6]。

曲霉病的診斷通常以組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)曲霉菌特征性的菌絲作為依據(jù)。Sangoi[7]為了評(píng)估真菌感染與培養(yǎng)組織學(xué)診斷的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了10年的回顧性研究，總結(jié)了組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中真菌感染形態(tài)的鑒定，描述了較多經(jīng)常被忽視的診斷問題，尤其是分枝的，有隔膜的菌絲組，如曲霉菌。雖然曲霉菌是常見的致病真菌，但并非所有這種分枝菌絲都代表曲霉菌。鐮刀菌和皮膚癬菌都可以與曲霉菌具有相似的形態(tài)外觀，但接受的治療策略完全不同。Montone[8]使用雙重?zé)晒鈽?biāo)記的寡核苷酸探針組成DNA和LNA的混合物，該測定能夠區(qū)分石蠟包埋的組織切片中的曲霉菌和鐮刀菌，而這兩種真菌很難在組織學(xué)上準(zhǔn)確直接區(qū)分。石蠟包埋的組織切片中這兩種病原體都是透明、有分隔的分枝真菌，曲霉菌通常為45°角分枝，而鐮刀菌為隨機(jī)分枝，在組織中這種差異可能非常難以識(shí)別。雖然這兩種病原體都會(huì)產(chǎn)生危及生命的感染，但由于鐮刀菌和曲霉菌適宜的抗真菌藥物并不完全相同，所以區(qū)分它們是至關(guān)重要的。在感染的病理組織中區(qū)別毛霉菌和曲霉菌的菌絲也并不容易。例如，曲霉菌菌絲有時(shí)可呈囊性擴(kuò)張，而當(dāng)毛霉菌的菌絲較狹窄，并能在菌絲內(nèi)見到少數(shù)中隔時(shí)，通過形態(tài)學(xué)鑒定更為困難。鼻腔毛霉菌病是最富有暴發(fā)性的，可通過組織迅速播散，菌絲常侵犯血管壁并長入管腔，引起阻塞性血栓，加速感染的播散和相應(yīng)組織的梗死，嚴(yán)重者可累及鼻、眼和大腦，常導(dǎo)致死亡，因此早期確診病原菌的意義重大。本研究用FISH技術(shù)檢測了50例石蠟包埋標(biāo)本，其中有32例呈陽性反應(yīng)，可以確定為曲霉菌。同時(shí)也提示了其他18例陰性患者可能為其他真菌種屬感染。

Hayden等[9]設(shè)計(jì)了用于檢測5種真菌生物的18SrRNA和28SrRNA序列的探針，對(duì)每種真菌都具有高度的特異性。這5種真菌包括了皮炎芽生菌、球孢子菌、新生隱球菌、組織胞漿菌和申克氏孢子絲菌，均在組織學(xué)上表現(xiàn)為圓形酵母狀結(jié)構(gòu)。通過原位雜交技術(shù)可以特異性地檢測出不同的真菌，為組織切片中酵母樣菌的鑒定提供了一種快速、準(zhǔn)確的技術(shù)。它的主要優(yōu)勢在于能夠準(zhǔn)確鑒定出極少量、或不典型的病原菌。Oliveira[10]發(fā)現(xiàn)的都柏林念珠菌是一種傳統(tǒng)上被鑒定為白念珠菌的單獨(dú)物種，他設(shè)計(jì)了針對(duì)白念珠菌和都柏林念珠菌的rRNA的肽核酸(PNA)探針，并將它們應(yīng)用于肽核酸-熒光原位雜交方法(PNA FISH)，用于鑒別白念珠菌和都柏林念珠菌?？涤崂騕11]探討FISH用于診斷小鼠皮膚中型無綠藻感染模型的可行性，通過FISH成功檢測出了小鼠皮膚中型無綠藻感染模型組織中的無綠藻病原體，結(jié)果與PAS染色和HE染色一致。

與其他常規(guī)方法諸如直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、組織病理、PCR等比較，本研究的創(chuàng)新點(diǎn)和臨床意義在于：①利用了石蠟切片，避免反復(fù)取材給患者帶來的痛苦；②所需時(shí)間短，可達(dá)到快速診斷的目的；③PAS、六胺銀和真菌熒光染色僅能提示是否有真菌感染，但卻不能鑒定是何種真菌感染；④本法是DNA的特異性擴(kuò)增技術(shù)，可以直接鑒定曲霉的種屬；⑤可利用存放多年的石蠟切片，實(shí)驗(yàn)所需用切片標(biāo)本量少，不影響蠟塊的保存和重復(fù)使用。

在FISH技術(shù)操作過程中蛋白酶消化是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]，若在此步驟處理不當(dāng)，會(huì)影響最終結(jié)果。所以組織進(jìn)行酶消化后應(yīng)在顯微鏡下觀察，控制好酶消化的程度。FISH可檢測出石蠟包埋組織中的曲霉菌感染，也可以推廣檢測血液、分泌物或新鮮組織等其他各種臨床標(biāo)本。這樣可以盡早和準(zhǔn)確地診斷出致病真菌，合理選用抗真菌藥物。