武曉英，喬宏萍，劉桂蘭，曹貴東

（1.太原師范學(xué)院生物系，山西晉中030619；2.天津渤海農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)聯(lián)合研究院有限公司，天津300308；3.山西瑞象生物藥業(yè)有限公司，山西太原030032）

砷中毒可以抑制體內(nèi)抗氧化酶的功能，使細(xì)胞的分裂和增殖紊亂，引起機(jī)體氧化損傷[1]，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2-3]。全世界有超過(guò)20個(gè)國(guó)家因高砷水源而引起砷中毒，我國(guó)也是受飲水型砷中毒危害最嚴(yán)重的國(guó)家之一[4-5]。砷污染是一個(gè)不容忽視的公共衛(wèi)生問(wèn)題[6-7]，在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害著機(jī)體健康。砷中毒可直接損傷雄性生殖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，致使雄性生殖功能障礙、精子質(zhì)量下降、繁殖性能受到嚴(yán)重影響[8-9]。硒（Se）是人體和動(dòng)物必需的微量元素，具有對(duì)抗自由基，保護(hù)蛋白質(zhì)、DNA以及染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能免受氧化損傷的能力[10]。硒和雄性動(dòng)物的生殖關(guān)系也非常密切，它以硒蛋白的形式參與精子的發(fā)生過(guò)程和睪丸的正常發(fā)育。已有研究報(bào)道，硒的補(bǔ)充有效改善了雞的精液品質(zhì)，精子畸形率顯著降低[11]。硒對(duì)重金屬的毒性具有緩解作用，它有效改善了鎘引起的氧化應(yīng)激，提高了雞免疫系統(tǒng)的防御能力[12]。目前，砷對(duì)睪丸發(fā)育的毒性研究已有大量報(bào)道[8-9]，但硒對(duì)砷中毒引起的睪丸毒性緩解作用并不清楚。

本試驗(yàn)選用昆明小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，采用砷飲水染毒處理并灌胃硒，通過(guò)小鼠抗氧化力、睪丸組織細(xì)胞的凋亡等檢測(cè)，為硒對(duì)砷誘導(dǎo)的睪丸損傷緩解的作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取4～6周齡，體質(zhì)量20～22 g的雄性昆明小鼠18只用于試驗(yàn)。小鼠購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 18只健康的小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只連續(xù)稱(chēng)質(zhì)量記錄，分別為對(duì)照組（C組）、砷組（A組）和砷硒聯(lián)合組（A＋Se組）。

小鼠預(yù)飼7d，之后進(jìn)入試驗(yàn)期。3組小鼠自由采食，C組飲用蒸餾水，A組和A+Se組飲用含50mg/kg砷（As2O3）的蒸餾水，C組和A組每天1次灌胃0.5 mg/kg蒸餾水，A＋Se組每天1次灌胃0.5 mg/kg亞硒酸鈉。連續(xù)處理60 d，試驗(yàn)結(jié)束后稱(chēng)小鼠體質(zhì)量，同時(shí)解剖小鼠稱(chēng)睪丸組織質(zhì)量。采用摘眼球法取小鼠血液析出血清凍存于-20℃冰箱，以測(cè)定抗氧化性能，同時(shí)解剖小鼠睪丸組織，制備切片用于組織病理學(xué)檢測(cè)。

1.2.2 小鼠血清、睪丸組織抗氧化指標(biāo)檢測(cè) 小鼠血液樣品析出血清后直接進(jìn)行氧化指標(biāo)檢測(cè)；睪丸組織依據(jù)南京建成生物工程研究所提供的操作方法，用生理鹽水制備10%的組織勻漿，離心取上清檢測(cè)總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化力（T-AOC）活性及丙二醛（MDA）含量。

1.2.3 精子形態(tài)學(xué)觀察 收集附睪中的精液，經(jīng)離心獲取精子，稀釋至適當(dāng)濃度后采用巴氏染色法制片進(jìn)行觀察，每個(gè)樣品連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)精子，測(cè)定精子畸形率。

1.2.4 小鼠睪丸組織HE切片制備 小鼠睪丸組織采用常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋后切片觀察。病理切片制備過(guò)程為：10%中性甲醛溶液固定；乙醇梯度脫水；60～65℃下組織樣品浸蠟；石蠟組織包埋；切片機(jī)切片；58～60℃烘干機(jī)烘片30～60 min；二甲苯脫蠟；蘇木素伊紅染色；乙醇梯度脫水封片；觀察，拍照。

1.2.5 小鼠睪丸組織的TUNEL檢測(cè) 小鼠睪丸組織用甲醛固定并制備石蠟切片，切片利用地高辛標(biāo)記凋亡細(xì)胞DNA的3′-OH末端，通過(guò)生物素標(biāo)記的抗地高辛抗體反應(yīng)再結(jié)合SABC，最后加入DAB顯色，于顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)細(xì)胞凋亡TUNEL結(jié)果進(jìn)行分析，每個(gè)樣本觀察不少于5個(gè)視野，并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，然后用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 砷、硒對(duì)小鼠體質(zhì)量和睪丸組織質(zhì)量變化的影響

在60 d的試驗(yàn)期，C組與A＋Se組小鼠飲食與生長(zhǎng)發(fā)育良好，A組則從砷處理的第3周開(kāi)始，食欲下降，生長(zhǎng)遲緩，出現(xiàn)嚴(yán)重掉毛現(xiàn)象。從表1可以看出，C組小鼠體質(zhì)量雖高于A＋Se組，但差異不顯著（P＞0.05），C組和A＋Se組小鼠體質(zhì)量均顯著高于A組小鼠（P＜0.05）；A組小鼠睪丸組織質(zhì)量極顯著低于C組（P＜0.01），顯著低于A＋Se組（P＜0.05）。

表1 不同組別小鼠體質(zhì)量和睪丸組織質(zhì)量比較 g

2.2 砷、硒對(duì)小鼠血清中抗氧化指標(biāo)的影響

從表2可以看出，A＋Se組小鼠血清中T-SOD和GSH-Px的活性顯著高于C組（P＜0.05），極顯著高于A組（P＜0.01），A組活性顯著低于C組（P＜0.05）；比較不同組別小鼠血清中T-AOC的活性，A+Se組極顯著高于A組和C組（P＜0.01），C組顯著高于A組（P＜0.05）；A＋Se組小鼠血清中MDA含量顯著高于C組（P＜0.05），極顯著低于A組（P＜0.01）。

表2 不同組別小鼠血清中抗氧化指標(biāo)比較

2.3 砷、硒對(duì)小鼠睪丸組織抗氧化性能的影響

從表3可以看出，不同組別小鼠睪丸中T-SOD和GSH-Px的活性，A＋Se組顯著高于C組（P＜0.05），極顯著高于A組（P＜0.01），A組活性顯著低于C組（P＜0.05）；不同組別小鼠睪丸中T-AOC的活性，A＋Se組極顯著高于A組和C組（P＜0.01），C組顯著高于A組（P＜0.05）；A＋Se組小鼠睪丸組織中MDA含量顯著高于C組（P＜0.05），極顯著低于A組（P＜0.01）。

表3 不同組別小鼠睪丸組織抗氧化性能比較

2.4 砷、硒對(duì)小鼠精子畸形率的影響

從表4可以看出，C組小鼠附睪中沒(méi)有完全缺陷型精子，A組和A＋Se組小鼠附睪中都有完全缺陷型精子，A組極顯著高于A＋Se組（P＜0.01），A＋Se組小鼠精子畸形率極顯著低于A組（P＜0.01），顯著高于C組（P＜0.05）；所有組別中畸形率發(fā)生最高的種類(lèi)是頸部和中段缺陷。

表4 不同組別小鼠精子畸形率比較

2.5 砷、硒對(duì)小鼠睪丸組織HE染色與細(xì)胞凋亡的影響

由圖1可知，C組睪丸組織中生精小管結(jié)構(gòu)完整，生精上皮細(xì)胞排列規(guī)則，管腔大小均勻，管內(nèi)有大量成熟精子，未見(jiàn)脫落細(xì)胞；A組為染砷組，生精小管形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞排列松散，管腔增大，生精細(xì)胞和成熟精子數(shù)量減少，管腔內(nèi)出現(xiàn)脫落細(xì)胞；A＋Se組為砷染毒同時(shí)聯(lián)合添加硒組，與A組比較生精細(xì)胞數(shù)量增加，形態(tài)結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，對(duì)砷的毒性起到明顯的拮抗作用。

從圖2～3可以看出，A組小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡數(shù)量極顯著高于C組與A＋Se組（P＜0.01），C組睪丸組織凋亡細(xì)胞數(shù)量雖低于A＋Se組，但差異不顯著（P＞0.05）。A組睪丸組織中除精原細(xì)胞外，初級(jí)精母細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞也發(fā)生細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)論與討論

3.1 硒對(duì)砷染毒小鼠血清及睪丸組織抗氧化性能的影響

重金屬元素可以引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[13-14]，刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），破壞氧化系統(tǒng)和抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡，平衡一旦被破壞就會(huì)直接或間接損傷細(xì)胞內(nèi)各種成分，組織受到氧化損傷。氧化應(yīng)激也是砷毒性的重要原因[15]。LIU等[16]研究發(fā)現(xiàn)，鉛能引起大鼠肝臟氧化應(yīng)激。硒可以通過(guò)拮抗重金屬元素保護(hù)機(jī)體，主要體現(xiàn)在能提高機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化力（T-AOC）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等重要抗氧化酶的活性[17]，保護(hù)細(xì)胞化合物免受ROS誘導(dǎo)的損傷[10]，維持蛋白質(zhì)和DNA的結(jié)構(gòu)以及功能的穩(wěn)定。在小鼠鉛中毒的研究中發(fā)現(xiàn)，硒能有效地緩解鉛對(duì)小鼠造成的神經(jīng)毒性[12]。本試驗(yàn)中，C組和A＋Se組小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)良好。A組小鼠3周之后表現(xiàn)為食欲下降、生長(zhǎng)緩慢和掉毛的現(xiàn)象。通過(guò)檢測(cè)各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)，A組小鼠血清和睪丸中T-SOD、GSH-Px和T-AOC的活性明顯降低，添加硒后，A＋Se組小鼠血清與睪丸中SOD、GSH-Px和T-AOC的活性極顯著高于A組（P＜0.01），顯著高于C組（P＜0.05）；檢測(cè)指標(biāo)中的MDA是ROS破壞生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化的產(chǎn)物。試驗(yàn)結(jié)果顯示，A組小鼠生物膜受損嚴(yán)重，MDA含量極顯著高于C組與A＋Se組（P＜0.01）。

3.2 硒對(duì)砷染毒小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡和精子形態(tài)的影響

細(xì)胞凋亡亦稱(chēng)細(xì)胞程序性死亡，是生命的基本現(xiàn)象，通過(guò)對(duì)凋亡機(jī)制的闡明可以揭示許多生理和病理現(xiàn)象的本質(zhì)[13，18-19]。在精子發(fā)生過(guò)程中，生成的精子和死亡精子之間的動(dòng)態(tài)平衡維持了精子的正常數(shù)量，由生精細(xì)胞的正常凋亡來(lái)維持。然而，生精細(xì)胞過(guò)度凋亡則可造成睪丸發(fā)育不全、精子發(fā)生異常，導(dǎo)致雄性不育[20]。氧化應(yīng)激是砷致雄性生殖毒性及雄性不育的重要原因[15]。有研究表明，砷暴露會(huì)損傷小鼠睪丸結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)睪丸氧化應(yīng)激，減少附睪精子，引起精子發(fā)生障礙[21-23]。

本試驗(yàn)中，A＋Se組睪丸組織HE染色的結(jié)果顯示，生精細(xì)胞數(shù)量較A組增加，形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，明顯對(duì)砷的毒性起到拮抗作用；而且細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，A＋Se組睪丸組織中的細(xì)胞凋亡數(shù)目極顯著低于A組，凋亡只發(fā)生于精原細(xì)胞，初級(jí)精母細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞凋亡。