索慧英，鄭 密，盧 晗，曲冠證，李 瑩＊

(1. 東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 哈爾濱體育學院，黑龍江 哈爾濱 150008；3. 東北林業(yè)大學林木育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

楊樹是林木遺傳研究的模式樹種[1]，是北半球種植面積最廣，適應性最強的落葉闊葉樹種[2]，在我國生態(tài)建設中發(fā)揮著巨大的作用。近年來，我國楊樹轉基因已取得重大進展，主要集中在其重要的經濟及生態(tài)價值的基因功能研究上。小黑楊(Populus simonii×P. nigra)是 小 葉 楊 （Populus simoniiCarr）與歐洲黑楊（Populus nigraL.）的雜交品種，其生長迅速、抗寒、抗旱性強，生態(tài)潛力巨大，在中國北方得到了廣泛種植[3]。近年來，對于小黑楊的研究主要集中在利用轉基因技術來增強抗病性[4]、抗蟲性[5]、耐鹽性[6-7]以及基因功能的研究[8-9]等方面，利用蛋白質組學對小黑楊進行研究的報道相對較少。然而，蛋白質作為生命活動的主要承擔者[10]，執(zhí)行大多數的生物功能，通過蛋白質組學的研究可以獲取在遺傳層面無法獲得的信息，因此，進行蛋白質組學的研究具有很高的價值。

蛋白質組學的概念最初是由澳大利亞科學家Wilkins等[11]提出的，蛋白質組學研究中最常用的技術之一是雙向電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)[12],雙向電泳技術與質譜技術相結合，已成為蛋白質組學中分離蛋白質的有效方法[13]。雙向電泳技術已經被廣泛應用于植物的蛋白質組學研究中，如Romeo等[14]通過雙向電泳技術分析意大利楊根部響應鋅脅迫的關鍵因素，Liu等[15]利用雙向電泳技術分析了毛果楊早期莖從初生生長到次生生長的蛋白質組學的變化。盡管雙向電泳體系優(yōu)化已有廣泛研究，但由于植物的生物學特性、生理生化特性不盡相同，對于不同植物物種，最適的電泳條件不同[16]。因此，必須針對植物的不同特點進行雙向電泳體系的優(yōu)化以進行蛋白質組學的研究。楊樹葉片富含色素、多酚、多糖、有機酸等次生代謝物質，對電泳過程干擾很大，導致雙向電泳圖譜背景高、蛋白質不清晰，從而使楊樹葉片雙向電泳技術和蛋白質組學的研究受到很大的限制。因此，在進行楊樹葉片蛋白質組學的研究之前，對楊樹葉片蛋白質的雙向電泳體系進行優(yōu)化是十分重要的。

目前，關于楊樹葉片蛋白質雙向電泳體系優(yōu)化相關的研究尚未見報道。本研究以小黑楊葉片為材料，對雙向電泳技術中的主要影響因素進行探討，探究出了適用于小黑楊葉片蛋白質組學研究的雙向電泳體系；該體系同樣適用于大青楊與84 K楊葉片的蛋白質雙向電泳，因此，該雙向電泳體系可用于楊樹葉片蛋白質組學的分析，并為其他木本植物葉片的蛋白質組學的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗以東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室溫室內種植的小黑楊、大青楊和84 K楊為材料。從植株上剪下長20.0 cm，徑0.5～1.0 cm的枝條，并將枝條插入裝有草炭土、蛭石和珍珠巖（體積比為5:3:2）的塑料盆中。培養(yǎng)條件：溫度25～30℃，濕度70%～80%，光照16 h·d-1。扦插苗培養(yǎng)3個月后，采集自莖尖起的第3～5片葉片，將采摘下來的葉片立刻放入液氮中速凍處理，裝入樣品袋，將葉片碾碎后混合，存放于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試劑和儀器

使用的主要藥品有二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、硫脲、尿素、十二烷基硫酸鈉、Tris base、甘氨酸均購自 Sigma公司；IPG buffer、固相 pH梯度IPG干膠條、礦物油均購于美國GE Helthcare公司；乙二胺四乙酸、氯化鈉、丙三醇、苯甲咪鹽酸水合物、β-甘油磷酸二鈉水合物、三氯乙酸、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺、無水乙醇、冰乙酸、硝酸銀、無水乙酸鈉、硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、甲醛、戊二醛、考馬斯亮藍R250均購自國藥集團化學試劑有限公司；TritonX-100、溴酚藍、過硫酸銨、丙烯酰胺、N,N’一甲叉雙丙烯酰胺均購自Biotopped公司；標準分子量蛋白Marker購自Thermo公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；其他常規(guī)試驗試劑均為國產分析級試劑。

使用的主要儀器有冷凍離心機（Eppendorf，德國），超聲波細胞粉碎機（蘭儀，上海），萬分之一天平（Sartorius，德國），高速冷凍離心機離心機（Eppendorf，德國），漩渦混合器（Crystaln，美國），制冰機（Scotaman，意大利），酶標儀（永創(chuàng)，上海），水浴鍋（中興偉業(yè)，北京），Ettan IPGphor3 (GE Helthcare，美國)，EttanDALTsix(GE Helthcare， 美 國 )， ImageScanner Ш (GE Helthcare，美國)，ImageMasterTM2D Platinum 7.0(GE Helthcare，美國)。

1.3 方法

1.3.1 小黑楊葉片蛋白質雙向電泳體系的優(yōu)化 本研究以小黑楊葉片為材料，對小黑楊葉片蛋白質雙向電泳體系的2D裂解液、蛋白的純化、IPG膠條的pH范圍、蛋白上樣量、等電聚焦時間和SDS平衡時間進行優(yōu)化。

1.3.1.1 雙向電泳裂解液的選擇 蛋白樣品提取后需要用2D裂解液重新溶解再進行雙向電泳實驗。本實驗選擇了2種2D裂解液溶解小黑楊葉片蛋白質 ， 即 ： 2D 裂 解 液Ⅰ （ 9.8 mol·L-1Urea， 4%CHAPS，10% DTT）和 2D 裂解液Ⅱ（7 mol·L-1Urea， 2 mol·L-1Thiourea， 4% CHAPS， 10%DTT），比較2種2D裂解液對小黑楊葉片蛋白質分離的影響。

1.3.1.2 小黑楊葉片蛋白樣品的純化 小黑楊葉片蛋白質提取后含有較多的多糖、多酚等非蛋白類物質，影響雙向電泳圖譜的分辨率。為了獲得高純度的蛋白質樣品，提高蛋白質的分離效果，筆者對小黑楊葉片蛋白質樣品進行純化。本實驗采用TCA-丙酮法和2D clean-up kit法對小黑楊葉片蛋白質進行純化，采用純化后的蛋白樣品進行雙向電泳實驗，比較2種方法對小黑楊葉片蛋白質的純化效果。

三氯乙酸—丙酮（TCA-丙酮）法：取280 μL蛋白上清液于1.5 mL離心管中，加入1.4 mL-20℃保存的蛋白提取液 I（含 0.07% β-巰基乙醇，10% 三氯乙酸），上下顛倒混勻，-80℃存放2 h。12 000 g，4℃，離心20 min。棄除上清，用蛋白提取液II（含0.07% β-巰基乙醇）洗滌沉淀3次，直至沉淀呈白色。將沉淀真空干燥3～5 min，取適量 2D 裂解液（7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，1%DTT，4%CHAPS）溶解蛋白樣品。將樣品進行液氮冷凍處理，-80℃冰箱保存。

2D clean-upkit（GE，美國）法：取 100 μL 蛋白上清液加入300 μL沉淀劑，混勻，冰上培育15 min；再加入 300 μL共沉淀劑，混勻；4℃，12 000 g離心5 min；離心后棄去上清液，在離心管中加入 40 μL共沉淀劑，冰浴 5 min；4℃，12 000 g離心5 min；棄上清，加入25 μL去離子水，振蕩5～10秒；加入1 mL預冷的洗滌緩沖液和5 μL洗滌添加劑，振蕩直至沉淀完全散開，置于-20℃冰箱保存30 min；4℃，12 000 g離心5 min，將上清液移走棄去，用適量的2D裂解液溶解沉淀，4℃，12 000 g離心5 min，留取上清，將蛋白樣品液氮冷凍，放-80℃冰箱中保存以備日后分析。1.3.1.3 IPG膠條pH范圍的選擇 進行等電聚焦前需要選擇合適的pH范圍的IPG膠條，使用不同pH范圍的IPG膠條分離小黑楊葉片蛋白質得到的雙向電泳圖譜的分辨率不同。為了找到適用于小黑楊葉片蛋白質分離的IPG膠條的pH范圍，本實驗分別采用24 cm、pH 3～10和pH 4～7的線性IPG膠條進行雙向電泳實驗，比較2種不同范圍的IPG膠條對小黑楊葉片蛋白質的分離效果。

1.3.1.4 蛋白上樣量的選擇 進行等電聚焦前筆者對蛋白上樣量進行選擇。為了獲得能夠呈現(xiàn)更多的蛋白質信息且分辨率較高的雙向電泳圖譜，本實驗分別取600 μg和1 mg蛋白樣品進行雙向電泳實驗，比較2種蛋白上樣量可檢測到的蛋白質的數目和蛋白質的分離效果。

1.3.1.5 等電聚焦時間的選擇 在等電聚焦程序的設定中，10 000 V的等電聚焦時間會影響蛋白質的分離效果。為了獲得背景清晰，分辨率較高的雙向電泳圖譜，本實驗對10 000 V的等電聚焦時間進行優(yōu)化，比較6、11、13 h對小黑楊葉片蛋白質的分離效果。

1.3.1.6 SDS平衡時間的選擇 等電聚焦結束后需要對膠條進行平衡，平衡時間的長短會影響雙向電泳圖譜的分辨率。為了找到合適的平衡時間，本實驗設定了3個平衡時間，分別為：40、50、60 min，將平衡好的膠條進行SDS-PAGE（Sodium Dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis）電泳，分析不同平衡時間對雙向電泳圖譜分辨率的影響。

1.3.2 小黑楊、大青楊和84 K楊葉片蛋白質雙向電泳圖譜的建立

1.3.2.1 小黑楊、大青楊和84 K楊葉片總蛋白質的提取 參考索慧英等[17]方法。分別取小黑楊、大青楊和84 K楊葉片，每種葉片取3份，每份1 g，分別加入液氮研磨至細粉。將樣品分別轉移至15 mL離心管中，每份加入1.5 mL蛋白裂解液（2 mmol·L-1EDTA，137 mmol·L-1NaCl，40 mmol·L-1Tris-HCl (pH 6.8)，1 mol·L-1DTT，1%TritonX-100，10%Glycerol，0.5 mmol·L-1benzamidine，50 mmol·L-1β-glycerophosphate），充分混勻，冰浴條件下超聲破碎處理 6 min（φ2，26℃，3/9sec）；12 000 g，4℃，離心20 min；留取上清，分別將每種葉片提取出的蛋白上清液轉移至一個離心管中，充分混合均勻后進行液氮冷凍處理，存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 小黑楊、大青楊和84 K楊葉片總蛋白質的純化 采用2D clean-upkit法對小黑楊、大青楊和84 K楊葉片總蛋白質進行純化，操作步驟見1.3.1.2，其中，獲得的蛋白沉淀用2D裂解液Ⅱ進行溶解。將蛋白樣品液氮冷凍，放-80℃冰箱中保存。

1.3.2.3 蛋白質含量的測定 本實驗采用改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒（生工，上海）測定蛋白濃度，使用牛血清蛋白（BSA）作為標準樣品，分別取濃度為1 mg·mL-1的BSA標準溶液0、4、8、12 μL于0.5 mL的離心管中，用去離子水分別添加至終體積為40 μL，旋渦振蕩混合均勻。分別從每管中取出20 μL溶液加入到酶標板中，在每個孔中分別加入200 μL的Bradford工作液，吸打混勻，室溫反應5 min。使用酶標儀讀取波長為595 nm的吸光值，以不同BSA含量（mg）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

將待測蛋白樣品稀釋至合適濃度，按照上述操作步驟測定蛋白樣品的吸光值，記錄吸光值。根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應的蛋白含量，除以樣品稀釋液的總體積，乘以樣品稀釋倍數即為樣品的實際濃度。每個樣品重復測定3次，取平均值做為該樣品的濃度值。

1.3.2.4 雙向凝膠電泳 第一向等電聚焦（Isoelectric focusing，IEF），取1 mg蛋白樣品加入水化液 (9.8 mol·L-1Urea，0.002%BPB，2%IPG buffer，2%CHAPS)至總體積為 450 μL，充分混勻，將樣品自左而右線性加入到水化槽中，將24 cm、pH 4～7線性IPG膠條保護膜去除，膠面朝下緩慢的置于樣品溶液上并覆蓋礦物油，將水化槽置于等電聚焦儀中。在20℃條件下進行等電聚焦，等電聚焦參數設置見表1。

等電聚焦結束后將膠條進行兩步平衡。第一步：將膠條置于平衡緩沖液I（75 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.8)，6 mol·L-1Urea，30% Glycerol，2% SDS，1% DTT）中平衡40 min。第二步：將膠條轉移到平 衡 緩 沖 液 II（ 75 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.8)，6 mol·L-1Urea，30% Glycerol，2% SDS，2.5% 碘乙酰胺）中平衡40 min。平衡結束后進行第二向SDS-PAGE電泳，分離膠的濃度為13%，電泳條件為1 W·gel-1，電泳30 min后調整為13 W·gel-1，至溴酚藍指示劑到達距凝膠底部1 cm處停止電泳，將凝膠取出，進行銀染染色。

1.3.2.5 銀染及圖像的掃描與分析 參考嚴冬等[18]方法。固定30 min，致敏30 min，漂洗3次，每次10 min；染色20 min后立即水洗2次，每次1 min；顯色至蛋白質點清晰后終止5 min。染色后的凝膠利用ImageScanner Ш掃描儀與ImageMasterTM2D Platinum 7.0分析軟件進行圖像的采集與分析，分辨率為300 dpi。

2 結果與分析

2.1 小黑楊葉片蛋白質雙向電泳體系的優(yōu)化

2.1.1 雙向電泳裂解液的選擇 本研究比較了2D裂解液Ⅰ和2D裂解液Ⅱ對蛋白質分離的影響。選用24 cm、pH 3～10的線性IPG膠條，蛋白上樣量為300 μg，進行雙向電泳。圖1表明：使用2D裂解液Ⅰ的圖譜（圖1a）中可檢測到117個蛋白質，圖中蛋白質的溶解性差，堿性端蛋白質個數少，且蛋白質的聚焦效果不好，未能有效分離；使用2D裂解液Ⅱ的圖譜（圖1b）分辨率高，可檢測到326個蛋白質。實驗結果表明：選用2D裂解液Ⅱ溶解小黑楊葉片蛋白質可獲得分辨率較高的2-DE圖譜。

表 1 等電聚焦程序Table 1 The program of isoelectric focusing electrophoresis

圖 1 2種2D裂解液溶解的小黑楊葉片蛋白質的2-DE圖譜Fig. 1 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves dissolved with two kinds of 2D lysis buffer

2.1.2 小黑楊葉片蛋白樣品的純化 本研究比較了TCA-丙酮法和2D clean-up kit法對小黑楊葉片總蛋白質純化的效果。選用24 cm、pH 3～10的線性IPG膠條，蛋白上樣量為600 μg，進行雙向電泳。圖2表明：采用TCA-丙酮法（圖2a）純化的蛋白樣品，可檢測到364個蛋白質，其雙向電泳圖譜有較高的背景，蛋白質未能有效分離且大分子量的蛋白聚焦效果較差；采用2D clean-up kit法（圖2b）純化的蛋白樣品，其雙向電泳圖背景清晰，圖譜分辨率較高，蛋白質的整體聚焦效果好，可檢測到的蛋白質個數為450個。實驗結果表明：2D clean-up kit法適用于小黑楊葉片雙向電泳蛋白樣品的純化。

2.1.3 IPG膠條pH范圍的選擇 本研究比較了pH 3～10和pH 4～7的線性IPG膠條對蛋白質分離的效果。選用24 cm的IPG膠條，蛋白上樣量為600 μg進行雙向電泳。圖3表明：采用pH 3～10的IPG膠條的雙向電泳圖譜（圖3a）中，小黑楊葉片蛋白主要分布在酸性端至中性區(qū)域，堿性端分布較少，可檢測到354個蛋白質；采用pH 4～7的IPG膠條（圖3b）分離所得蛋白在凝膠上分布比較均勻，可檢測到393個蛋白質，分離效果明顯優(yōu)于前者，更有利于蛋白質組學研究中差異蛋白質的分離和鑒定。該實驗結果表明：小黑楊葉片中的堿性蛋白較少，主要集中在酸性端且主要分布在pH 4～7范圍內，所以pH 4～7的IPG膠條適用于小黑楊葉片蛋白質的分離。

圖 2 2種純化方法純化的小黑楊葉片蛋白質的2-DE圖譜Fig. 2 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves purified by two kinds of purification methods

圖 3 不同pH范圍的IPG膠條分離的小黑楊葉片蛋白質的2-DE圖譜Fig. 3 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves separated with different IPG pH ranges

2.1.4 蛋白上樣量的選擇 本研究對蛋白上樣量600 μg和 1 mg進行比較，選用 24 cm、pH4～7的線性IPG膠條進行雙向電泳。圖4表明：蛋白上樣量為600 μg的圖譜（圖4a）可檢測到393個蛋白質；蛋白上樣量提高到1 mg（圖4b）可檢測到蛋白質的個數明顯增加，低豐度蛋白得以顯現(xiàn)，可檢測到454個蛋白質。實驗結果表明：本研究的雙向電泳體系可以對1 mg的小黑楊葉片蛋白質進行很好的分離。

圖 4 不同上樣量的小黑楊葉片蛋白質的2-DE圖譜Fig. 4 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves with different loading amount

2.1.5 等電聚焦時間的選擇 本研究對10 000 V的等電聚焦時間進行了優(yōu)化，比較了6、11、13 h條件下等電聚焦的效果。本研究選用24 cm、pH 4～7的膠條，蛋白上樣量為1 mg進行雙向電泳。圖5表明：聚焦時間為6 h的電泳圖譜（圖5a）中，蛋白質的聚焦不充分有水平拖帶，且蛋白質未能有效分離，通過軟件分析可檢測到的蛋白質的個數為454個；聚焦時間為11 h的圖譜（圖5b）中，可分辨的蛋白質的個數明顯增加，可檢測到510個蛋白質，聚焦效果明顯增強，但仍存在水平拖尾；聚焦時間為13 h的圖譜（圖5c）中，圖像背景清晰，橫向拖帶較少，可檢測到539個蛋白質，且膠圖中各蛋白質圓滑清晰，聚焦情況良好。實驗結果表明：蛋白上樣量達到1 mg，10 000 V的等電聚焦時間為13 h時膠圖中蛋白點的聚焦效果好，所獲得的圖譜分辨率較高。

圖 5 不同聚焦時間小黑楊葉片蛋白質的2-DE圖譜Fig. 5 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves with different IEF time

2.1.6 SDS平衡時間的選擇 本研究對平衡時間40、50、60 min進行比較分析。本實驗采用pH 4～7，24 cm的膠條，蛋白上樣量為1 mg進行雙向電泳。圖6表明：平衡時間為40 min時，可檢測的蛋白質的個數為539個（圖6a）；平衡時間延長至50 min時，蛋白質的個數減少，可檢測到436個蛋白質（圖6b）；當平衡時間延長至60 min時，隨著膠條中蛋白損失量的逐漸增加，蛋白質的顯色程度逐漸降低，可檢測到的蛋白質為363個（圖6c）。結果表明：在小黑楊葉片蛋白質的分離中，適宜的平衡時間為40 min。

圖 6 不同平衡時間下小黑楊葉片蛋白質的2-DE圖譜Fig. 6 2-DE profiles of proteins from Populus simonii×P. nigra leaves with different equilibration time

2.2 小黑楊、大青楊和84 K楊葉片蛋白質雙向電泳圖譜的建立

本研究采用優(yōu)化后的雙向電泳體系對小黑楊（圖7a）、大青楊（圖7b）和84 K楊（圖7c）的葉片蛋白質進行雙向電泳實驗，選用2D裂解液Ⅱ溶解蛋白樣品，2D clean-up kit法純化蛋白樣品，使用24 cm、pH 4～7的IPG膠條，蛋白上樣量為1 mg，10 000 V的等電聚焦時間為13 h，平衡時間為40 min進行雙向電泳。獲得的圖譜分別可檢測到531、828和525個蛋白質，且蛋白質的分離效果較好，圖譜的分辨率較高。結果表明：本研究優(yōu)化的雙向電泳體系適用于楊樹葉片蛋白質組學的研究。

圖 7 3種楊樹葉片蛋白質的2-DE圖譜Fig. 7 2-DE profiles of proteins from three kinds of poplar leaf

3 討論

3.1 蛋白質組學在木本植物研究中的應用

目前，蛋白質組學技術在白樺(Betula platyphyllaSuk.)[19]、 旱柳 (Salix matsudanaKoidz)[20]、 茶樹（Camellia sinensis(L.)O. Kuntze）[21]及楊樹[15]等植物的蛋白質組學研究中進行了廣泛的應用，在推動木本植物蛋白功能的研究與發(fā)展中起到了重要的作用。如寧德利[22]利用蛋白質組學技術分析了小黑楊頂芽進入休眠、保持休眠及解除休眠3個階段的蛋白質的變化，獲得了74個差異蛋白質；張小玲等[23]利用蛋白質組學技術分析了楊樹不同種質成熟花粉萌發(fā)的特性及致敏蛋白的差異，發(fā)現(xiàn)不同種質間楊樹的花粉活力、致敏蛋白的數量及表達量存在明顯差異。對于楊樹葉片蛋白質組學的研究也有一些報道，如Kieffer等[24]研究了鎘脅迫對楊樹葉片蛋白質表達的影響，獲得了125個差異表達蛋白質，對118個差異蛋白進行了鑒定與分析，闡明了碳代謝與氧化脅迫機制參與楊樹葉片鎘脅迫的應答；岳寧等[25]對胡楊（Populus euphraticaOliv.）異形葉鋸齒闊卵型以及披針形葉片蛋白質分別進行雙向電泳實驗，對圖譜比較分析后發(fā)現(xiàn)了73個差異表達蛋白質，揭示了胡楊為了適應生存環(huán)境，葉片中蛋白質的表達發(fā)生了變化，形成了不同形狀的葉片；金鑫[26]對小黑楊葉片參與H2O2脅迫應答的蛋白質進行了分析，獲得了81個小黑楊葉片響應H2O2脅迫的差異表達蛋白質。由于楊樹葉片中含有較多的多糖、酚類及核酸等物質，對蛋白質的分離產生了較大的影響，導致在楊樹葉片蛋白質組學的研究中獲得的差異蛋白質的個數較少，圖譜的背景較高，圖譜不夠清晰。為了進一步獲得更多的差異蛋白質，對蛋白質的功能進行全面的研究與分析，對楊樹葉片蛋白質雙向電泳體系進行優(yōu)化是十分必要的。迄今為止，楊樹葉片蛋白質雙向電泳體系優(yōu)化相關的研究尚未見報道。在蛋白質組學的研究中，獲得高質量的雙向電泳圖譜，在2-DE凝膠展示更多的蛋白質是進行后續(xù)分析的前提，因此，對楊樹葉片蛋白質進行雙向電泳體系的優(yōu)化可為后續(xù)的楊樹葉片蛋白質組學的研究奠定基礎。

3.2 適用于雙向電泳的楊樹葉片總蛋白質的制備

在雙向電泳體系中，蛋白樣品制備的好壞直接關系到圖譜質量的好壞。在進行等電聚焦前需要將蛋白樣品重新溶解，確保樣品在2D裂解液中有良好的溶解性，這對獲得分辨率高且蛋白質個數多的二維凝膠圖譜是至關重要的。尿素是一種常用的離液劑，在蛋白質的溶解中應用較多，它可以改變或破壞蛋白質內部的氫鍵、疏水鍵等次級鍵的結構，使蛋白質變性及蛋白酶失活[27]。硫脲是一種增溶劑，在膜蛋白的提取中應用較多[28]，但由于其不溶于水，溶于高濃度尿素的特性，需與尿素混合使用[29]；硫脲可提高蛋白的溶解性，增強2-DE的效果。本研究采用尿素與硫脲聯(lián)用的2D裂解液Ⅱ溶解小黑楊葉片蛋白質獲得了蛋白質個數多、聚焦效果較好的雙向電泳圖譜。

小黑楊葉片中富含多糖、色素、核酸等物質，在膠圖中呈現(xiàn)出較高的背景，影響蛋白質的識別。本研究采用TCA-丙酮沉淀法與2D clean-up kit法對獲得的蛋白樣品進行純化，TCA-丙酮沉淀法是基于蛋白在酸和/或疏水條件下變性使蛋白濃縮并去除污染物的原理[30]，最早用于小麥蛋白的提取，是目前提取植物蛋白的常用方法之一。TCA能有效地抑制蛋白酶對蛋白質的水解作用，保證在制樣過程中蛋白質不被降解[31]；然而，該方法的最大的缺點是樣品中的非蛋白成分很難去除[32]，導致雙向電泳圖譜有較高的背景，從而掩蓋部分蛋白質，影響蛋白質組學的分析。2D clean-up kit法可通過定量沉淀蛋白質去除核酸、鹽類、脂類和酚類等干擾物質，在苜蓿細胞壁[33]和豌豆種子[34]的蛋白質樣品制備中已有使用報道；同時，該方法可以有效的濃縮蛋白樣品，特別適用于上樣量大的樣品。本研究通過比較2種蛋白純化方法發(fā)現(xiàn)，對于小黑楊葉片蛋白而言，采用2D clean-up kit對蛋白樣品進行純化可有效去除雜質和干擾物質，獲得背景清晰，分辨率較高的雙向電泳圖譜，可滿足小黑楊蛋白質組學研究的要求。

3.3 楊樹葉片總蛋白質雙向電泳圖譜分辨率的提高

雙向電泳對蛋白質的分離效果主要受IPG膠條的pH范圍、蛋白上樣量和等電聚焦條件等因素的影響。選擇合適的pH范圍的膠條能提高圖譜的分辨率，通常情況下選擇pH 3～10的膠條進行分離蛋白質，選用較寬pH范圍的膠條，可以使雙向電泳圖譜中呈現(xiàn)更多的蛋白質，更能全面反映植物組織細胞內蛋白質的表達情況；但如果膠條的pH范圍與蛋白樣品中蛋白的等電點范圍相差較大，則會使蛋白過于集中無法完全分離，造成部分蛋白點重合影響分析效果[35]。G?rg等[36-37]研究表明，使用窄pH范圍的IPG膠條分離蛋白質樣品，可提高圖譜的分辨率,并可提高該pH范圍內所檢測到的蛋白質的數量。在本研究中，與pH 3～10的IPG膠條相比，采用pH 4～7的IPG膠條可以分離出更多的蛋白質。

合適的蛋白上樣量可以提高雙向電泳圖譜的分辨率。上樣量過低，低豐度蛋白難以檢測，可檢測到的蛋白質少。提高上樣量有利于低豐度蛋白的檢測，但上樣量過高會產生橫縱條紋，高豐度蛋白會影響其他蛋白的分離和分析[29]，蛋白質容易凝聚或沉淀而造成損失。在膠條的長度及染色方法確定的前提下，優(yōu)化上樣量對提高蛋白質的分離效果和增加低豐度蛋白的檢測均具有重要意義。本研究中，小黑楊葉片蛋白質的上樣量為1 mg時可以檢測到更多的蛋白質，獲取更多的蛋白質信息。

等電聚焦程序的設置會影響蛋白質的分離效果，聚焦時間與膠條的長度、pH范圍、兩性電解質載體及蛋白樣品的上樣量有關[28]。聚焦不完全會造成圖譜中有大量的橫向拖尾、蛋白質不能有效分離，蛋白質的等電點難以確定。聚焦過度會造成橫條紋、蛋白質的損失和蛋白質漂移。在本研究中，采用10 000 V的等電聚焦時間為13 h對小黑楊葉片蛋白質進行分離,可以獲得分辨率較高的雙向電泳圖譜。

SDS平衡的主要目的是促使SDS與蛋白分子充分結合，保證蛋白分子在第二向中能夠進行有效的遷移；平衡時間過短，蛋白沒有結合足夠的SDS，易產生縱向拖尾；平衡時間過長大量蛋白會從IPG膠條中出來進入平衡液中，造成蛋白的損失。

4 結論

本研究優(yōu)化后的雙向電泳體系為：采用2D裂解液Ⅱ溶解總蛋白質，用2D clean-up kit法對總蛋白質進行純化，選用24 cm、pH 4～7的線性IPG膠條，蛋白上樣量為1 mg，10 000 V的等電聚焦時間為13 h，SDS平衡時間為40 min。利用優(yōu)化后的雙向電泳體系對小黑楊、大青楊和84 K楊葉片蛋白質進行雙向電泳實驗，分別可檢測到531、828、525個蛋白質，得到的蛋白質分離效果好，雙向電泳圖譜背景清晰，分辨率高，重復性好。本研究成功的建立了小黑楊、大青楊與84 K楊葉片蛋白質的雙向電泳圖譜，該體系可滿足小黑楊、大青楊與84 K楊蛋白質組學的分析和研究，為楊樹葉片蛋白質組學的研究奠定了基礎。