徐珀

【摘要】 目的 分析P21活化激酶1（PAK1）在腎癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 選取75例腎癌患者的芯片（HKidE150CS03）， 采用免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行PAK1檢測。比較腎癌不同組織（癌旁組織和癌組織）中PAK1陽性檢出率及不同分期、不同病理分化程度PAK1陽性檢出率。結(jié)果 癌組織中PAK1陽性檢出率為84%， 高于癌旁組織中的12%， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ⅰ～Ⅱ期患者PAK1陽性檢出率為77.36%， Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1陽性檢出率為100.00%;Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1陽性檢出率高于Ⅰ～Ⅱ期患者， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.930， P<0.05）。病理高分化患者PAK1陽性檢出率為92.59%， 中低分化患者PAK1陽性檢出率為89.58%， 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.185， P>0.05）。結(jié)論 PAK1蛋白在腎癌的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移中有促進(jìn)作用， PAK1高表達(dá)可能成為腎癌診斷、侵襲性和預(yù)后判斷的重要生物學(xué)參考指標(biāo)， 因此臨床檢測中， 可將PAK1蛋白表達(dá)水平作為腎癌發(fā)展程度的預(yù)測因子。

【關(guān)鍵詞】 腎癌;P21活化激酶1;癌旁組織;腎癌組織

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.09.019

腎小管上皮出現(xiàn)惡性腫瘤稱為腎癌， 其發(fā)病率在腎臟類腫瘤中高達(dá)90%。近年來隨著我國人口老齡化的上升， 腎癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢， 其中男性腎癌發(fā)病率為6.09/10萬， 女性腎癌發(fā)病率為3.84/10萬[1]。腎癌發(fā)生初期并無明顯癥狀， 隨病情發(fā)展患者有血尿或鏡下血尿情況， 患者確診時(shí)多為癌癥晚期， 已錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)[2]。鑒于此近年來研究人員致力于腎癌分子標(biāo)記物診斷的研究， 將癌旁組織、腎癌組織中小分子物質(zhì)水平進(jìn)行比較， 發(fā)現(xiàn)PAK1在腎癌組織中呈現(xiàn)出高水平表達(dá)， PAK1對肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）、腫瘤抑制因子有磷酸化作用， 達(dá)到促進(jìn)癌細(xì)胞繁殖的目的[3， 4]。因此本研究驗(yàn)證PAK1在腎癌組織中的表達(dá)情況， 并進(jìn)一步分析PAK1的表達(dá)與臨床意義， 詳細(xì)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取上海芯超生物科技有限公司75例腎癌患者的芯片（HKidE150CS03）作為研究對象， 其中男51例， 女24例;年齡34～82歲， 平均年齡（56.5±11.1）歲;腫瘤直徑：<7 cm 45例， 7～10 cm23例， >10 cm 7例;臨床分期：Ⅰ期35例， Ⅱ期18例， Ⅲ～Ⅳ期22例;病理分化程度：高分化27例、中低分化48例;腫瘤部位：左腎36例， 右腎38例， 腎上1例。

1. 2 方法

1. 2. 1 儀器、試劑準(zhǔn)備 兔抗人PAK1多克隆抗體， 由上海信裕生物技術(shù)有限公司提供;熒光定量PCR試劑盒， 由北京眾智領(lǐng)先科技有限公司提供， 該公司同時(shí)提供定量PCR檢測儀。此外需準(zhǔn)備辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光圖像成像系統(tǒng)等設(shè)備。準(zhǔn)備完成檢測設(shè)備、試劑完好程度， 并進(jìn)行試檢測。

1. 2. 2 免疫組化法 即對細(xì)胞組織切片、染色， 標(biāo)記PAK1蛋白， 觀察其表達(dá)情況。具體檢測步驟如下：蠟封組織直接切片， 進(jìn)行脫蠟操作， 水化同時(shí)進(jìn)行高壓抗原修復(fù)， 恢復(fù)細(xì)胞組織狀態(tài)。加山羊血清、過氧化氫（3%）實(shí)施封閉操作， 將細(xì)胞組織置于4℃環(huán)境下， 放置一夜， 孵育二抗1 h， 用對二甲胺基偶氮苯（DAB）染色后顯色， 再用蘇木精重復(fù)染色操作， 脫水處理同時(shí)封片。染色后若PAK1蛋白表達(dá)水平高且檢測結(jié)果為陽性， 染色呈棕褐色、黃色。將染色細(xì)胞置于顯微鏡5倍視野下觀測， 記錄陽性細(xì)胞數(shù)量。染色強(qiáng)度評分：無色0分;淺黃色1分;黃色、棕色2分;棕褐色3分;>2分即為PAK1陽性。

1. 2. 3 PAK1水平表達(dá)檢測 采用Western印跡檢測法， 步驟如下：對細(xì)胞組織作特殊處理， 將其蛋白質(zhì)完全提取出來， 用蛋白質(zhì)定量法（BCA）檢測蛋白濃度。試樣作離心處理， 取上清液35 μg， 進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜與封閉操作， 在4℃室溫下完成一抗孵育。試樣中加入二抗完全混合均勻， 用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影操作， 放置于全自動(dòng)系統(tǒng)中得到相應(yīng)蛋白質(zhì)檢測條帶。

1. 3 觀察指標(biāo) ①統(tǒng)計(jì)比較腎癌患者PAK1在腎癌不同組織（癌旁組織和癌組織）中的陽性檢出率。②比較不同分期及不同病理分化程度腎癌患者PAK1陽性檢出率。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 PAK1在腎癌不同組織中陽性檢出率比較 癌組織中PAK1陽性檢出率為84%， 高于癌旁組織的12%， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 不同分期及不同病理分化程度腎癌患者PAK1陽性檢出率比較 Ⅰ～Ⅱ期患者PAK1陽性檢出率為77.36%， Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1陽性檢出率為100.00%;Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1陽性檢出率高于Ⅰ～Ⅱ期患者， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.930， P<0.05）。見表2。病理高分化患者PAK1陽性檢出率為92.59%， 中低分化患者PAK1陽性檢出率為89.58%， 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.185， P>0.05）。見表3。

3 討論

近年來人類飲食結(jié)構(gòu)、生活方式等變化較大， 腎癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢， 最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示， 我國腎癌發(fā)病率位居泌尿系統(tǒng)腫瘤第二位。在全球范圍內(nèi)腎癌發(fā)病率在成年人惡性腫瘤中占比3%， 且發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的地域差異[5]。為控制腎癌發(fā)生率， 國內(nèi)外學(xué)者不斷深入探究其病因， 目前腎癌已知病因分析如下。①遺傳因素。研究顯示腎癌多由常染色體顯性遺傳為主， 父親或母親患有腎癌， 其后代中出現(xiàn)腎癌幾率明顯高于正常人， 據(jù)統(tǒng)計(jì)遺傳性腎癌在所有患者中占比不高， 僅4%左右[6]。②誘發(fā)因素。肥胖是業(yè)界公認(rèn)的誘發(fā)腎癌的危險(xiǎn)因素之一， 隨著體重指數(shù)的增加， 腎癌發(fā)生率就越高;吸煙也是導(dǎo)致腎癌的危險(xiǎn)因素之一， 大量臨床實(shí)踐研究證實(shí)， 有吸煙史人群患上腎癌的相對危險(xiǎn)度為1.3。③高血壓、獲得性囊性腎臟疾病也是腎癌發(fā)生的高危因素[7， 8]。目前臨床治療水平不斷提升， 腎癌診斷從晚期逐漸向早期過度， 通過對Ⅰ類蛋白酶、Ⅱ類蛋白酶等的研究， 發(fā)現(xiàn)PAK1蛋白與癌細(xì)胞組織發(fā)展程度有關(guān)。

腎癌患者臨床表現(xiàn)極其復(fù)雜， 癌細(xì)胞激素分泌水平與病灶的不斷轉(zhuǎn)移使患者呈現(xiàn)出多種表現(xiàn)。腎癌具有較長潛伏期， 其特點(diǎn)是增殖快， 具有侵襲性與進(jìn)展性。PAK1蛋白在不同臨床分期的表達(dá)水平有一定差異性， 于俊杰等[9]在研究中指出， P21活化激酶4（PAK4）在腎細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)， PAK1蛋白與PAK4蛋白表達(dá)具有一定相似性， 采用免疫組織化學(xué)兩步法進(jìn)行檢測， 結(jié)果顯示PAK4蛋白在臨床分期T1、T2、T3～4期癌組織中的陽性表達(dá)率分別為59.3%、90.5%、100.0%， 可見隨著分期的增加PAK蛋白呈現(xiàn)出遞增趨勢。這與本次研究結(jié)果一致， 本次研究結(jié)果顯示， Ⅰ～Ⅱ期患者PAK1陽性檢出率為77.36%， Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1陽性檢出率為100.00%;Ⅲ～Ⅳ期患者PAK1陽性檢出率高于Ⅰ～Ⅱ期患者， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.930， P<0.05）。病理高分化患者PAK1陽性檢出率為92.59%， 中低分化患者PAK1陽性檢出率為89.58%， 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.185， P>0.05）。本次研究采用腎癌組織、癌旁組織作為研究對象， 利用免疫組化方法對PAK1在腎癌細(xì)胞組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。檢測顯示， 癌組織中PAK1陽性檢出率為84%， 高于癌旁組織中的12%， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。劉耀雷、孔垂?jié)?、黃耿等[10-12]對Polo樣激酶1、蛋白激酶Cα在腎癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析， 檢測腎癌組織、癌旁組織中酶蛋白的表達(dá)， 發(fā)現(xiàn)癌旁組織中陽性檢出率明顯低于腎癌組織， 這與本研究結(jié)果一致。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Polo樣激酶1、蛋白激酶Cα的表達(dá)與PAK1蛋白在腎癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)出協(xié)同性， 因此將其與本研究作對比， 相似度較高[13， 14]。

綜上所述， PAK1蛋白在腎癌的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移中有促進(jìn)作用， PAK1高表達(dá)可能成為腎癌診斷、侵襲性和預(yù)后判斷的重要生物學(xué)參考指標(biāo)， 因此臨床檢測中， 可將PAK1蛋白表達(dá)水平作為腎癌發(fā)展程度的預(yù)測因子。

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[收稿日期：2020-01-09]