葉芳麗，將翡翎，潘在興，魏小斌，吳翔宇

(海口市人民醫(yī)院檢驗科，海南海口 570208)

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，其以進展快及患者預后差為主要特點，由于患病初期癥狀不明顯導致大部分患者確診時已處于癌癥晚期，嚴重危及女性健康[1]。目前臨床常采用手術并輔以放化療治療卵巢癌，但其副作用較大且嚴重降低術后患者生活質量，因而探尋早期診斷卵巢癌的特異性標志物對提高治療效果及改善患者預后具有重要意義。微小RNA(miRNA)作為一類內源性非編碼RNA分子，研究證實miRNAs與多種惡性腫瘤發(fā)生過程密切相關并可作為多種惡性腫瘤治療的靶標基因[2]。微小RNA34(miR-34)是一種與腫瘤細胞增殖、凋亡有關的重要基因并可調節(jié)多種基因表達[3]。研究顯示胰島素樣生長因子ⅡmRNA結合蛋白3(IMP3)可通過與胰島素樣生長因子相互作用進而參與多種腫瘤細胞增殖過程[4]。通過Gene Cards網(wǎng)站預測IMP3為miR-34的靶基因，關于miR-34與IMP3在卵巢癌中的表達研究尚未見報道，因此本研究主要探討卵巢癌組織中miR-34與IMP3表達變化，分析其與患者臨床參數(shù)及預后的關系，為臨床早期診斷及治療卵巢癌提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月至2018年12月本院收治的92例卵巢癌患者的手術中切除的癌組織標本為卵巢癌組，另選取距癌組織邊緣大于5 cm的相應癌旁組織標本為對照組，所有患者均經(jīng)病理證實為卵巢癌，將卵巢癌組織及癌旁組織標本凍存于-80 ℃超低溫冰箱。年齡45～71歲，平均(52.51±7.15)歲，收集卵巢癌患者臨床病理資料，包括腫瘤大小、病理類型、病理分級、淋巴結轉移、臨床分期、分化程度、腹腔積液轉移等。按照世界衛(wèi)生組織將卵巢癌患者病理類型進行分類，其中漿液性癌 23例，黏液性癌 32例，內膜樣癌 37例[5]。臨床分期為Ⅰ期 16例、Ⅱ期 25例、Ⅲ期 51例[6]。分化程度：高分化 23例、中分化 41例、低分化 28例；腹腔積液轉移患者53例，未轉移患者39例。納入標準：(1)卵巢癌患者均經(jīng)手術病理證實；(2)術前未接受化療、放療者；(3)癌旁組織經(jīng)病理證實無癌細胞浸潤者；(4)患者知情且簽署同意書。排除標準：(1)自身免疫性疾病者；(2)肝腎功能嚴重損傷患者；(3)合并其他惡性腫瘤者；(4)臨床資料不完整者；(5)心力衰竭及原發(fā)性高血壓患者。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量(qPCR)檢測卵巢癌組織中miR-34與IMP3 mRNA相對表達量 采用qPCR法檢測卵巢癌組織中miR-34與IMP3 mRNA相對表達量。取出凍存卵巢癌組織及癌旁組織標本。(1)提取總RNA：按照Trizol試劑盒說明書操作；(2)反轉錄：將2 μg RNA反轉錄為cDNA(RNA反轉錄試劑盒)；(3)配qPCR反應體系：按照SYBR Green RCR master mix試劑說明配反應體系(20 μL)，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，ddH2O 6.0 μL。將其置于熒光定量PCR儀上進行反應，程序設定為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。miR-34以U6為內參基因，IMP3以β-actin為內參基因，引物設計見表1。反應結束后對所得數(shù)據(jù)循環(huán)閾值(Ct值)進行分析，采用2-ΔΔCt算法計算miR-34與IMP3 mRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2免疫組化法檢測卵巢癌組織中IMP3蛋白表達 將卵巢癌組織標本制作為石蠟切片并連續(xù)切片(厚度為4 μm)，二甲苯脫蠟與不同濃度乙醇脫水后進行熱抗原修復，過氧化氫(3%)滅活后采用山羊血封閉，具體步驟均嚴格按照SP試劑盒說明書操作，其中IMP3抗體稀釋比為1∶100(美國Abnova公司)，DAB(北京中杉金橋生物技術有限公司)顯色，蘇木素復染并將其在不同濃度乙醇中脫水，中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下觀察。結果判定：從每個切片中選取5～10個高倍視野并統(tǒng)計陽性染色細胞數(shù)量[7]。(1)染色程度記分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；(2)陽性細胞數(shù)評分：陽性細胞百分比≤10% 為1分，10%～50% 為2分，50%～75%為 3分，>75% 為4分。取兩組計分之乘積：≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.3隨訪 通過打電話訪問、門診復查等方式對所有卵巢癌患者進行隨訪，隨訪3年后繪制Kaplan-Meier曲線并統(tǒng)計無生存進展期(PFS)與總體生存時間(OS)。

2 結 果

2.1兩組miR-34與IMP3 mRNA表達水平比較 與對照組相比，卵巢癌組患者miR-34表達水平顯著降低，而IMP3 mRNA表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組miR-34與IMP3 mRNA表達水平比較

2.2卵巢癌組織中IMP3蛋白表達結果 免疫組化顯示IMP3定位于腫瘤細胞細胞質，染色呈黃色、棕黃色、棕褐色，見圖1。與對照組相比，卵巢癌組IMP3蛋白陽性表達率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

注：A為陰性表達，B為陽性表達。

圖1卵巢癌組織中IMP3蛋白表達情況(×400)

表3 卵巢癌組織中IMP3蛋白表達結果

表4 miR-34、IMP3表達與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關系[n(%)]

續(xù)表4 miR-34、IMP3表達與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關系[n(%)]

2.4卵巢癌患者miR-34與IMP3表達的相關性 Pearson法分析卵巢癌患者miR-34與IMP3表達的關系，結果顯示miR-34與IMP3呈顯著負相關(r=-0.608，P=0.000)，見圖2。

圖2 卵巢癌患者miR-34與IMP3表達的相關性分析

2.5miR-34、IMP3表達與卵巢癌患者預后的關系 Kaplan-Meier法分析miR-34、IMP3表達與卵巢癌患者預后(PFS、OS)的關系，結果顯示與miR-34低表達組PFS(20.03%)、OS(21.02%)相比，miR-34高表達組PFS(41.20%)、OS(42.21%)均顯著升高(P<0.05)；與IMP3陰性表達組PFS(45.13%)、OS(52.17%)相比，IMP3陽性表達組PFS(30.03%)、OS(26.15%)均顯著降低(P<0.05)，見圖3、4。

注：A為PFS曲線，B為OS曲線。

圖3卵巢癌患者miR-34表達與PFS、OS的關系

注：A為PFS曲線，B為OS曲線。

圖4卵巢癌患者IMP3表達與PFS、OS的關系

3 討 論

卵巢癌患者病死率極高，其發(fā)病機制尚未完全闡明，同時由于缺乏早期診斷卵巢癌的特異性標志物導致診斷及治療效果不佳[8]。研究顯示miRNAs可通過調控下游靶基因的表達進而參與卵巢癌發(fā)生及其腫瘤細胞增殖、遷移過程[9]。近來研究報道指出，部分miRNAs可用于早期診斷與評估癌癥患者預后的重要標志物，同時也可作為腫瘤治療靶點[10]。因此，本研究主要分析miR-34及其預測靶基因IMP3在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達及其臨床意義，旨在為臨床早期診療卵巢癌及改善患者預后提供科學依據(jù)。

miR-34的基因序列具有高度保守性，研究顯示miR-34又可分為miR-34a、miR-34b并可作為抑癌基因通過調控細胞周期進而誘導細胞凋亡[11]。研究證實miR-34在結腸癌組織中明顯下調并與TNM分期及淋巴結轉移緊密相關[12]。食管鱗狀細胞癌組織中miR-34過表達時可抑制腫瘤細胞生長[13]。P53可激活miR-34并促使其發(fā)揮其抑癌基因功能，同時miR-34可修復p53基因功能進而促進細胞增殖[14]。P53/miR-34a通路激活后可抑制腫瘤細胞增殖及分化并為治療方案提供理論支撐[15]。miR-34在卵巢癌中的作用研究尚未見報道，本研究通過qPCR檢測miR-34在卵巢癌組織中的表達，結果顯示卵巢癌組miR-34表達水平顯著低于對照組，說明卵巢癌組織中miR-34呈低表達，并可能參與卵巢癌的發(fā)生過程。卵巢癌患者臨床病理參數(shù)顯示卵巢癌組織中高分化miR-34表達顯著低于中/低分化；病理分級G1期miR-34表達顯著低于G2、G3期；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期患者miR-34表達顯著低于Ⅲ期患者；淋巴結轉移與腹腔積液轉移患者miR-34表達顯著高于無淋巴結轉移及無腹腔積液轉移患者，提示miR-34表達與卵巢癌患者疾病進展有關，可能參與卵巢癌發(fā)展過程。

癌胚蛋白IMP3具有促進腫瘤細胞增殖及分化的功能，并與胃癌患者疾病進展及預后有關[16]。研究顯示IMP3主要通過調控胰島素樣生長因子Ⅱ表達進而促進腫瘤細胞增殖，其在多種癌組織中呈高表達并可作為宮頸癌的標志物[17]。IMP3與P53共同作用可激活P53/Cyc信號通路進而提高癌細胞DNA增殖活性，同時可加快癌細胞早期分化調控因子的轉錄過程導致癌癥發(fā)生[18]。本研究結果顯示卵巢癌組IMP3 mRNA表達水平顯著高于對照組，免疫組化結果顯示卵巢癌組織中IMP3蛋白陽性表達率顯著高于對照組，說明IMP3在卵巢癌組織中呈高表達。進一步觀察其與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關系，結果顯示高臨床分期、高病理分級、低分化、淋巴結轉移及腹腔積液轉移的卵巢癌組織中IMP3蛋白陽性表達率顯著升高，提示IMP3蛋白表達與卵巢癌惡性程度有關并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程。卵巢癌患者預后較差且生存率極低，本研究采用Kaplan-Meier法分析miR-34、IMP3表達與卵巢癌患者預后的關系，結果顯示miR-34低表達、IMP3陽性表達患者生存期顯著降低，說明miR-34、IMP3表達與患者預后密切相關。同時本研究結果顯示miR-34與IMP3表達呈顯著負相關(r=-0.608，P=0.000)，分析其原因可能為miR-34低表達促使預測靶基因IMP3表達水平升高，IMP3與P53相互作用進而促使癌細胞增殖及分化導致病情惡化。本研究結果提示miR-34與IMP3可能參與卵巢癌發(fā)生及發(fā)展過程，并與卵巢癌患者預后密切相關。

4 結 論

綜上所述，卵巢癌組織中miR-34表達水平下調，IMP3蛋白表達水平上調，兩者呈負相關并均與患者臨床病理特征密切相關，且均可能成為評估卵巢癌患者預后的重要指標。本研究存在不足之處，關于miR-34與IMP3靶基因功能驗證及其具體作用機制有待進一步研究。