趙 靜，劉 軒，沈廣萍，王 靜

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院風濕免疫科，內蒙古呼和浩特 010050)

結核桿菌T細胞斑點實驗(T-SPOT.TB)是通用酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測結核桿菌感染特異性T細胞以診斷結核病的技術，其已成為檢測結核病的重要手段。風濕免疫病是一類以皮膚、關節(jié)、血管等損害為特點的常見病，主要包括痛風、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。該病患者治療中常應用的糖皮質激素和免疫抑制劑可影響結核菌素皮膚試驗結果，有學者認為T-SPOT.TB受機體免疫情況、糖皮質激素、免疫抑制劑的影響較小，更適合于風濕免疫病患者的肺結核檢測[1-2]。但同時也有學者認為淋巴細胞絕對值、中性粒細胞絕對值/淋巴細胞絕對值、是否合并肺外結核等因素與T-SPOT.TB診斷準確性有關[3-4]。因此關于T-SPOT.TB對風濕免疫病患者活動性肺結核診斷準確性的研究尚無統(tǒng)一結論。本實驗基于此點，探討風濕免疫病患者T-SPOT.TB診斷準確性的影響因素，旨在提升T-SPOT.TB在風濕免疫病患者診斷活動性肺結核中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2017年5月至2019年5月本院就診的100例疑似伴發(fā)活動性肺結核的風濕免疫病患者的臨床資料、臨床診斷結果、T-SPOT.TB檢查結果。納入標準：(1)患者符合類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等相應風濕免疫性疾病診斷標準[5]，并有咳嗽、咳痰、午后低熱、咯血等癥狀，胸部影像學檢查疑似活動性肺結核[6]；(2)年齡>18歲。排除標準：(1)嚴重感染、人類免疫缺陷病毒感染、惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全；(2)妊娠婦女；(3)臨床資料缺失。納入患者中包含類風濕性關節(jié)炎44例，骨關節(jié)炎6例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡26例，痛風18例，強直性脊柱炎8例。本實驗設計已由醫(yī)院倫理學委員會審核。

1.2儀器與試劑 HealForce培養(yǎng)箱、T-SPOT.TB試劑盒(均購自英國Oxford Immunote Ltd公司)，酶聯(lián)免疫熒光斑點分析儀(購自德國AID公司)，淋巴細胞分離液、Gibco AIM-V(購自上海復星長征醫(yī)學科學有限公司)，Gibco RPMI 1640細胞培養(yǎng)液(購自廣州碩恒生物科技有限公司)。

1.3方法 分析T-SPOT.TB對風濕免疫病患者伴發(fā)活動性肺結核的診斷效能，對比假陽性患者與真陽性+真陰性患者的臨床資料，以及假陰性患者與真陽性+真陰性患者的臨床資料，分析T-SPOT.TB檢查假陽、假陰結果產生的相關因素。

1.3.1患者活動性肺結核確診方法 參考《WS 288-2017肺結核診斷》[6]，結合患者癥狀和肺部影像學檢查、細菌學檢查、病理學檢查結果，排除其他肺部疾病后診斷為活動性肺結核。

1.3.2樣本準備 取患者外周靜脈血8 mL與BPMI 1640不完全培養(yǎng)液混勻，分離得出單個細胞層后置于離心管中，加入10 μL細胞懸液和0.4%細胞稀釋液40 μL。將制備好的細胞混合液加入細胞計數(shù)板中并行活細胞計數(shù)。在培養(yǎng)板中加入AIM-V無血清培養(yǎng)液50 μL、抗原A和抗原B 50 μL，設立50 μL的對照組，將培養(yǎng)板放置于5% CO2培養(yǎng)箱中孵育20 h，溫度設置為37 ℃。

1.3.3斑點計數(shù) 舍棄培養(yǎng)板孔中液體，在孔內加入新鮮酶標抗體溶液50 μL，于2～8 ℃下孵育1 h。加入底物溶液50 μL，室溫下反應7 min，用蒸餾水洗滌、干燥培養(yǎng)板。然后采用ELISPOT自動計數(shù)儀行斑點計數(shù)處理。

1.3.4T-SPOT.TB結果評估 以下情況為陽性結果：(1)陰性對照孔斑點數(shù)<6個，且抗原A或抗原B孔斑點數(shù)-陰性對照孔斑點數(shù)≥6個；(2)陰性對照孔斑點數(shù)≥6個，且抗原A或抗原B孔斑點數(shù)≥2倍的陰性對照孔斑點數(shù)。不符合上述情況則為陰性結果。

2 結 果

2.1T-SPOT.TB診斷效能 T-SPOT.TB診斷風濕免疫病患者伴發(fā)活動性肺結核的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為81.08%、42.31%、80.00%、44.00%，見表1。

表1 痰培養(yǎng)和T-SPOT.TB診斷結果(n)

2.2影響假陽結果產生的因素 在風濕免疫病疑似伴有活動性肺結核的患者中，T-SPOT.TB假陽性患者存在結核既往史、吸煙史的例數(shù)大于真陽性+真陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，假陽性患者與真陽性+真陰性患者其余資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 假陽結果產生的影響因素

注：*表示統(tǒng)計量為χ2，#表示統(tǒng)計量為t值，△表示統(tǒng)計量為Z值，▲表示采用Fisher確切檢驗；-表示無數(shù)據(jù)。

2.3影響假陰結果產生的因素 在風濕免疫病疑似伴有活動性肺結核的患者中，T-SPOT.TB假陰性患者結核性胸膜炎、結核性腦膜炎例數(shù)與真陽性+真陰性患者比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；假陰性患者與真陽性+真陰性患者其余資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4T-SPOT.TB產生假陽性結果的相關因素Logistic回歸分析 根據(jù)假陽性患者與真陽性+真陰性患者的臨床資料比較結果，選擇其中P<0.05的3個可能影響假陽性結果發(fā)生的相關因素進行Logistic回歸分析。分析顯示，結核既往史(OR=6.185，P=0.011)、吸煙史(OR=22.322，P=0.005)為T-SPOT.TB產生假陽性結果的危險因素，見表4。

表3 假陰結果產生的影響因素

注：*表示統(tǒng)計量為χ2，#表示統(tǒng)計量為t值，△表示統(tǒng)計量為Z值，▲表示采用Fisher確切檢驗；-表示無數(shù)據(jù)。

2.5T-SPOT.TB產生假陰性結果的相關因素Logistic回歸分析 根據(jù)假陰性患者與真陽性+真陰性患者的臨床資料比較結果，選擇其中P<0.05的2個可能影響假陰性結果發(fā)生的相關因素進行Logistic回歸分析。分析顯示，結核性胸膜炎(OR=13.827，P=0.003)、結核性腦膜炎(OR=20.303，P=0.001)為T-SPOT.TB產生假陰性結果的危險因素，見表5。

表4 T-SPOT.TB產生假陽性結果的相關因素Logistic回歸結果

注：-表示無數(shù)據(jù)。

表5 T-SPOT.TB產生假陰性結果的相關因素Logistic回歸結果

3 討 論

風濕免疫病患者由于治療中多使用糖皮質激素和免疫抑制劑[7]，導致機體免疫功能下降，因此更應留意結核感染風險[8]。但風濕免疫病患者較差的免疫力使得結核菌素皮膚試驗敏感性大大降低，痰培養(yǎng)亦受各種因素限制容易產生低陽性率[9-10]。T-SPOT.TB作為一種新型的結核分枝桿菌感染檢測手段，不僅彌補了結核菌素皮膚試驗、痰涂片的不足，還能反映機體病原體清除情況[11-12]。但部分研究認為T-SPOT.TB對某些患者的診斷效能并不理想[13-14]，且尚少見T-SPOT.TB對風濕免疫病患者診斷效能影響因素的研究。探索T-SPOT.TB對風濕免疫病伴疑似活動性肺結核患者的診斷準確性，可為改良結核病檢測手段、提升T-SPOT.TB應用價值帶來新的啟示。

國外有研究表明，在不同人群中T-SPOT.TB的診斷效能參差不齊，在某些因素影響下靈敏度可低于80%[15]。在本研究中，觀察到T-SPOT.TB診斷風濕免疫病患者伴發(fā)活動性肺結核的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為81.08%、42.31%、80.00%、44.00%，這可能是由于多種因素影響使得風濕免疫病患者T-SPOT.TB的診斷準確性降低。ZHANG等[15]研究中發(fā)現(xiàn)年齡、結核病史、糖皮質激素或免疫抑制劑應用史、淋巴細胞計數(shù)是T-SPOT.TB特異性降低的危險因素，在該實驗中123例帶有結核病史的患者T-SPOT.TB特異性低至39.5%。說明T-SPOT.TB對不同人群的活動性肺結核診斷效能不盡相同[16-17]，診斷結果可能受多種因素影響。

為探索風濕免疫病患者T-SPOT.TB診斷準確性的影響因素，本研究將15例假陽性患者、14例假陰性患者分別與71例真陽+真陰患者的T-SPOT.TB結果對比，并分析T-SPOT.TB診斷效能的影響因素，發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB假陽性患者存在結核既往史、吸煙史的例數(shù)大于真陽性+真陰性患者；T-SPOT.TB假陰性患者結核性胸膜炎、結核性腦膜炎例數(shù)與真陽性+真陰性患者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；結核既往史、吸煙史為T-SPOT.TB產生假陽性結果的危險因素，結核性胸膜炎、結核性腦膜炎為T-SPOT.TB產生假陰性結果的危險因素。這就意味著T-SPOT.TB的診斷效能可能在風濕免疫病患者中并不理想，結核既往史、吸煙史、并發(fā)癥類型影響著診斷準確性。LI等[18]對98例活動性肺結核患者、251例非結核病的人群T-SPOT.TB檢查結果進行分析，得出結論：并發(fā)結核性腦膜炎是T-SPOT.TB假陰性的危險因素，結核病史是該檢查假陽性的危險因素。PAN等[3]研究中發(fā)現(xiàn)：對于肺結核患者，T-SPOT.TB假陰性的危險因素包含年齡、體質量指數(shù)、病程；對于伴有肺外結核桿菌感染的患者，T-SPOT.TB假陰性的危險因素包含年齡、單核細胞數(shù)目。對于伴有這些因素的患者，醫(yī)師應留意其T-SPOT.TB結果的可信程度。另一方面，夏青等[19]認為T-SPOT.TB結果受淋巴細胞絕對值、中性粒細胞絕對值/淋巴細胞絕對值、血小板計數(shù)/淋巴細胞絕對值影響較大。風濕免疫病患者多接受糖皮質激素和免疫抑制劑的治療，這些藥物可影響患者免疫系統(tǒng)功能和免疫細胞數(shù)量，若患者長期接受糖皮質激素/免疫抑制劑治療、出現(xiàn)明顯免疫系統(tǒng)功能抑制[20]，其T-SPOT.TB結果可能存在疑問。結合本實驗結果，研究者認為T-SPOT.TB檢查雖具有許多優(yōu)點，但應用于風濕免疫病患者仍需考慮諸多影響因素。不論T-SPOT.TB結果如何，皆有必要對結果進行辨析，以防止誤診、漏診的發(fā)生。若條件允許，可將T-SPOT.TB與結核菌素皮膚試驗、痰涂片等檢查手段聯(lián)用，以提高檢測的診斷效能。

4 結 論

綜上所述，結核既往史、吸煙史是疑似伴發(fā)活動性肺結核的風濕免疫病患者T-SPOT.TB診斷假陽性的危險因素，伴發(fā)結核性胸膜炎或結核性腦膜炎是T-SPOT.TB假陰性的危險因素。