王 慶，羅 茂

(1.樂山市市中區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科，四川樂山 614000；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥物研究中心，四川瀘州 646000)

隨著當(dāng)代醫(yī)學(xué)對2型糖尿病(T2DM)的深入研究，人們認(rèn)識到T2DM本身并不會對患者生命造成較大威脅，而其引發(fā)的血管、腎臟、視網(wǎng)膜損害將嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。近年來，聽力損害作為T2DM的并發(fā)癥，正逐漸受到衛(wèi)生領(lǐng)域重視，相關(guān)調(diào)查報告顯示，糖尿病患者并發(fā)聽力障礙風(fēng)險為健康人群的2倍，其特征常見雙側(cè)對稱性、漸進(jìn)性、不可逆性病變[2]，且多以高頻聽力損害為主，表現(xiàn)為耳鳴、耳聾等癥狀，為患者日常生活帶來諸多不便。由于T2DM患者主觀感受、聽覺感受并不能確切反映其實際的聽力情況，因而并發(fā)耳鳴癥狀在早期并不容易察覺，即便通過純音測聽試驗也不能做出有效診斷[3]。然而全面的聽力學(xué)檢查項目較多，且試驗程序復(fù)雜，對測試儀器與測試者經(jīng)驗要求較高，早期篩查診斷仍較為困難?；诖耍狙芯繖z測了T2DM產(chǎn)生的全身性病變相關(guān)標(biāo)志物，分析了這些標(biāo)志物與并發(fā)耳鳴之間的潛在聯(lián)系，取得一定成果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 對2017年4月至2019年3月樂山市市中區(qū)人民醫(yī)院收治的64例T2DM并發(fā)耳鳴患者(觀察組)及148例單純T2DM患者(對照組)臨床資料進(jìn)行回顧性分析。觀察組男性34例，女性30例；年齡60～88歲，平均(76.33±5.41)歲；T2DM病程為7～20年，平均(14.94±3.26)年；空腹血糖(FPG)水平為(9.47±1.35)mmol/L，糖化血紅蛋白(HbA1c)水平為(8.82±0.73)%；耳鳴殘疾度量化表(THI)評分為(27.95±6.89)分。對照組男性76例，女性72例；年齡48～81歲，平均(65.12±9.50)歲；病程為3～18年，平均(11.60±4.18)年；FPG水平為(8.60±1.22)mmol/L，HbA1c水平為(8.26±0.59)%。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床表現(xiàn)及口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)檢測結(jié)果均符合T2DM相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡40～90歲；(3)中耳及前庭功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷為外耳道栓塞、中耳炎、耳硬化癥、內(nèi)耳畸形、鼓膜穿孔、梅尼埃病等耳部疾病因素或病毒感染、噪聲、爆震、外傷、中毒、顳頜關(guān)節(jié)疾病等直接因素引起的耳鳴；(2)存在意識、精神障礙而無法對耳鳴狀況進(jìn)行如實描述；(3)臨床資料不完整。

1.2方法 患者空腹?fàn)顟B(tài)下常規(guī)采集肘靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝管保存，30 min內(nèi)通過3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心機(jī)內(nèi)處理≥20 min，提取上清液保存于樣品管，在-80 ℃冰箱中凍存待測；確保批量測試周期≤3個月，測試采用纖維酶原激活物抑制物-1(PAI-1)、可溶性血管細(xì)胞黏附分子-1(sVCAM-1)、3-硝基酪氨酸(3-NT)、神經(jīng)生長因子(NGF)對應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(購自伊萊瑞特生物科技有限公司)，測試前24 h將血漿樣品轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱緩慢解凍，測試前30 min將血漿樣品與試劑盒轉(zhuǎn)移至實驗臺上平衡至室溫，在此期間準(zhǔn)備好稀釋液、工作液、洗滌液、底物溶液、終止液等所需試劑，取96孔板分別標(biāo)記空白孔、樣品孔及多個標(biāo)準(zhǔn)孔；向空白孔、樣品孔與首級標(biāo)準(zhǔn)孔中分別加入稀釋液、血漿樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液，逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液并確保每孔液體體積均為100 μL，混勻后覆膜在37 ℃恒溫箱中溫育1 h；傾去孔內(nèi)液體后甩干，加生物素化抗體工作液100 μL，混勻后覆膜在37 ℃恒溫箱中溫育1 h；傾去液體后每孔加入洗滌液350 μL，浸泡2 min后傾去，重復(fù)洗滌3次后在吸水紙上盡量拍干，每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，混勻后覆膜在37 ℃恒溫箱中溫育30 min；傾去液體后甩干，以上述方法洗滌5次并拍干，每孔加入底物溶液90 μL，混勻后覆膜、加蓋避光在37 ℃恒溫箱中溫育約15 min，終止時間以半數(shù)標(biāo)準(zhǔn)孔休閑肉眼可見顯色即可，以底物溶液相同順序加入終止液50 μL；通過酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量每孔光密度(A)，以空白孔數(shù)據(jù)校正背景，將孔梯度濃度與A值繪制為標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合出回歸方程，計算對應(yīng)樣品孔血漿樣品中對應(yīng)物質(zhì)的濃度水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組各指標(biāo)比較 觀察組血漿PAI-1、sVCAM-1、3-NT、NGF水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者血漿PAI-1、sVCAM-1、3-NT、NGF水平比較

2.2預(yù)測診斷效能分析 血漿PAI-1、sVCAM-1、3-NT、NGF單獨預(yù)測T2DM患者并發(fā)耳鳴ROC曲線AUC>0.5，Youden指數(shù)對應(yīng)cut-off值分別為8.06 mmol/L、58.50 ng/mL、269.79 pg/mL、4.16 ng/mL；4個指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測的ROC曲線AUC為0.796，均明顯大于單獨預(yù)測指標(biāo)(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各指標(biāo)單獨及聯(lián)合預(yù)測T2DM患者并發(fā)耳鳴的ROC曲線

表2 ROC曲線參數(shù)

注：與聯(lián)合預(yù)測比較，*P<0.05;-表示無數(shù)據(jù)。

2.3相關(guān)性分析 觀察組患者血漿PAI-1、sVCAM-1、3-NT、NGF水平與THI評分均表現(xiàn)出顯著正相關(guān)性(r>0，P<0.05)，見表3。

表3 各指標(biāo)與觀察組THI評分的Pearson相關(guān)性分析

3 討 論

PAI-1屬于纖溶系統(tǒng)的重要組成部分，其主要功能是通過抑制纖維酶原激活物(PA)活性，以調(diào)節(jié)整個纖溶系統(tǒng)平衡[4]。T2DM患者在血糖逐漸升高及糖耐量下降的同時，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，PAI-1過度釋放，纖溶抑制可隨之出現(xiàn)，引起血液高凝狀態(tài)，能促進(jìn)血栓形成，心、腦血管病變風(fēng)險極大增加[5]，是獨立于體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、糖尿病家族史等已知因素以外的危險因素。有關(guān)研究指出，血液流變學(xué)異?？稍黾游⒀苎h(huán)負(fù)擔(dān)，不僅基底膜增厚，管狀內(nèi)皮細(xì)胞也將出現(xiàn)病理增生，與糖尿病視網(wǎng)膜病變機(jī)制相仿，可加重耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積作用，形成典型的微循環(huán)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致聽覺損害[6]。本研究結(jié)果顯示，觀察組血漿PAI-1水平明顯高于對照組，與THI評分有明顯正相關(guān)性，ROC曲線顯示PAI-1≥8.06 mmol/L可高風(fēng)險提示為耳鳴，這表明血漿PAI-1能一定程度預(yù)測T2DM并發(fā)耳鳴及其嚴(yán)重程度，臨床檢測可通過參考閾值進(jìn)行早期篩查診斷。

sVCAM-1是免疫球蛋白超家族成員之一，主要由活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞表達(dá)，其配體為整合素家族的極遲抗原-4(VLA-4)，二者結(jié)合能介導(dǎo)細(xì)胞間相互黏附作用[7]。T2DM導(dǎo)致的廣泛炎性反應(yīng)，將促使動脈粥樣硬化病變進(jìn)程加快，并觸發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，白細(xì)胞更易于向內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)募集，刺激其過度表達(dá)sVCAM-1[8]。據(jù)相關(guān)研究報道，內(nèi)耳血流供應(yīng)主要依賴于小腦前下動脈分支，且由于其他代償動脈較少，一旦血管發(fā)生病變導(dǎo)致內(nèi)耳缺血，即便成功達(dá)成再灌注，也難以恢復(fù)耳蝸正常電位[9]。本研究中，觀察組血漿sVCAM-1水平明顯高于對照組，與THI評分正相關(guān)性良好，sVCAM-1≥58.50 ng/mL可提示存在較高耳鳴風(fēng)險。

T2DM由于存在葡萄糖自身氧化、蛋白質(zhì)非酶促糖基化、多元醇通路過度激活等作用產(chǎn)生廣泛的氧化應(yīng)激，不僅可進(jìn)一步損害胰島β細(xì)胞，還將減少外周組織對胰島素的敏感性[10]。3-NT作為蛋白質(zhì)硝基化的主要產(chǎn)物，是T2DM患者體內(nèi)一氧化氮被超氧陰離子氧化為過氧亞硝基陰離子(ONOO-)后造成蛋白質(zhì)氧化損傷的主要證據(jù)[11]。有學(xué)者認(rèn)為，ONOO-能對多種生物大分子產(chǎn)生過氧化與硝基化作用，能導(dǎo)致DNA鏈斷裂與多聚核苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)激活，對神經(jīng)病變與微血管病變均有較強(qiáng)促進(jìn)作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組血漿3-NT水平明顯高于對照組，與THI評分有明顯正相關(guān)性(r=0.473,P=0.011)，其cut-off值為269.79 pg/mL，因此T2DM患者3-NT水平越高，越容易并發(fā)更嚴(yán)重的耳鳴，早期檢測可一定程度反映患者微血管病變及神經(jīng)病變的程度。

NGF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，不僅能維持神經(jīng)細(xì)胞生理活動，還可促進(jìn)新生血管形成等非神經(jīng)組織生理活動。既往研究已證實隨著糖尿病病程延長，血管內(nèi)皮細(xì)胞損害與非酶促糖基化反應(yīng)加劇，NGF表達(dá)與HbA1c生成量同時增高[13]。針對糖尿病視網(wǎng)膜病變患者而言，視網(wǎng)膜低氧狀態(tài)可誘發(fā)視神經(jīng)細(xì)胞過度表達(dá)NGF以產(chǎn)生代償性保護(hù)作用，由于能提高新生血管網(wǎng)增生效率，將進(jìn)一步損害視功能[14]。趙振鹿等[15]在研究中提出，T2DM患者耳蝸小血管管壁增厚明顯，血管紋則有顯著萎縮，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)明顯缺失，神經(jīng)纖維則明顯減少，第Ⅷ顱神經(jīng)纖維束結(jié)構(gòu)變得更為松散，導(dǎo)致部分神經(jīng)軸索分裂為碎片，從而引起聽力障礙。本研究也發(fā)現(xiàn)，觀察組血漿NGF水平明顯高于對照組，與THI評分正相關(guān)性良好，其水平大于或等于4.16 ng/mL者更易于出現(xiàn)耳鳴，且聯(lián)合應(yīng)用上述指標(biāo)能提高對T2DM患者并發(fā)耳鳴的早期預(yù)測診斷效能，可作為全面聽力學(xué)功能測試前的迅速聯(lián)合篩檢項目應(yīng)用于臨床。

4 結(jié) 論

糖尿病并發(fā)耳鳴早期確診相對困難，有必要通過簡便易行的檢測方法提供診斷與評估信息。血漿PAI-1、sVCAM-1、3-NT、NGF水平作為生化指標(biāo)，均已證實與T2DM患者并發(fā)耳鳴嚴(yán)重程度存在確切正相關(guān)性。盡早通過實施聯(lián)合檢測，可為臨床干預(yù)提供指導(dǎo)，具有較高預(yù)測價值。