何 波,谷戰(zhàn)英,李紅英,黃敦元,3,*

1 重慶師范大學(xué),媒介昆蟲重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 401331 2 中南林業(yè)科技大學(xué), 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410004 3 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所 動(dòng)物進(jìn)化和系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101

近年來,由于氣候變化和人為因素的影響,野生蜜蜂面臨多種風(fēng)險(xiǎn),致使傳粉者的服務(wù)功能在全球許多地區(qū)嚴(yán)重下降[1- 5]。鑒于傳粉蜜蜂在經(jīng)濟(jì)作物授粉和野生植物繁衍方面的重要性,研究人員逐漸重視并嘗試保護(hù)這些野生蜜蜂資源[6- 8]。粉源植物的多樣性和筑巢地點(diǎn)的適應(yīng)性是影響野生蜜蜂物種多樣性最主要的因素[9- 10]。粉源植物多樣性通常使用野外觀察的方法,但具有一定的局限性,例如對(duì)觀察的時(shí)間和空間具有敏感性,并且在野外觀察條件下傳粉者的種類難以準(zhǔn)確鑒別。

孢粉學(xué)(Palynology),作為一種基于形態(tài)學(xué)鑒定花粉種類的方法,促進(jìn)了植物與傳粉者相互作用機(jī)制方面的研究[11- 13]。但其需要相當(dāng)?shù)姆诸悓W(xué)技巧和經(jīng)驗(yàn)[14],并且有些植物類群的花粉因缺乏顯著的物種識(shí)別特征而難以區(qū)分,如：桔梗科(Campanulaceae)和唇形科(Lamiaceae)[15- 16]。隨著DNA條形碼的發(fā)展,研究人員開始利用該方法來識(shí)別蜜蜂蜂糧中含有的植物種類[14, 17- 19]。Hawkins等[20]指出,與孢粉學(xué)相比,DNA條形碼可以更精確更迅速地鑒定出蜂糧中的物種組成,且不需要深厚的分類學(xué)研究基礎(chǔ)。

白斑切葉蜂(Megachilestrupigera)廣泛分布于中國(guó)南方地區(qū),是野生植物及農(nóng)林作物的重要傳粉昆蟲之一[21]。該蜂在江西地區(qū)1年2代,可在蘆葦管制作的人工巢箱內(nèi)進(jìn)行筑巢,并在其內(nèi)制作蜂糧來繁育后代[22]。本研究使用蘆葦管制作的人工巢管收集白斑切葉蜂,通過分子克隆并結(jié)合DNA條形碼技術(shù)鑒別蜂糧中的物種組成,以揭示不同樣地白斑切葉蜂粉源植物種類及多樣性,為該蜂的保護(hù)和可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究樣地概況

本研究在江西省選擇4種不同地貌類型的林地(圖1)。其中,新余市水北鎮(zhèn)(XYSB)和吉安市戈坪鄉(xiāng)(JAGP)地處中亞熱帶地區(qū),年均溫度19.1℃,這兩個(gè)樣地均為山地丘陵,森林植被類型以杉木(Cunninghamialanceolata)、濕地松(Pinuselliottii)和油茶(Camelliaoleifera)等人工林為主。贛州市沙地鎮(zhèn)(GZSD),地屬低海拔丘陵,年平均氣溫為19.1℃至20.4℃；該樣地以馬尾松(Pinusmassoniana)為主,林下雜灌密集并零星種植部分幼齡油茶。贛州市齊云山自然保護(hù)區(qū)(GZQYS),位于贛州市崇義縣西北邊緣地帶,地處羅霄山脈的南端,年平均氣溫17℃,屬濕潤(rùn)型季風(fēng)氣候帶,常年溫暖濕潤(rùn),雨量充沛；植被類型以常綠闊葉林為主,部分針葉樹種為輔的混交林。

1.2 樣品采集及DNA提取

根據(jù)白斑切葉蜂2個(gè)世代的主要發(fā)生時(shí)期(7月上旬和8月中旬),野外收集該蜂的筑巢巢管,并帶回實(shí)驗(yàn)室解剖,置于-30℃下保存?zhèn)溆?圖1)。同時(shí),對(duì)4個(gè)樣地每個(gè)巢箱周圍2 km為半徑范圍內(nèi)[23]的所有開花植物進(jìn)行采集,共收集到開花植物81種,用于建立專用的植物DNA參考數(shù)據(jù)庫(kù)(相關(guān)DNA序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù))。

蜂糧DNA提取前先將每個(gè)樣地單個(gè)時(shí)期采集的蜂糧混合成一個(gè)樣本,共得到8份含有花粉混合物的樣本。將每份樣本加入液氮,研磨時(shí)充分混勻,取100 mg用于DNA的提取。植物DNA提取使用新鮮葉片100 mg經(jīng)液氮研磨后用于DNA的提取。實(shí)驗(yàn)具體步驟參照QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit中的使用手冊(cè)。

1.3 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

開花植物和蜂糧分別進(jìn)行rbcL、trnH-psbA和ITS2基因序列的擴(kuò)增。rbcL擴(kuò)增引物為：rbcLa_For(5′-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC- 3′)和rbcLa_Rev(5′-GTAAAATCAAGTCCACCRCG- 3′)；trnH-psbA擴(kuò)增引物為：psbA3(5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC- 3′)和trnH05(5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC- 3′)；ITS2擴(kuò)增引物為：ITS2_S2F(5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT- 3′)和ITS2_S3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT- 3′)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：上下游引物各1 μL(10 μmol/L),DNA模板1 μL(50—100 ng),ddH2O 12.75 μL,dNTP 4 μL,10×LA PCR Buffer 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL,TaKaRa LA Taq酶(5 U/μL)0.25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s,52℃退火45 s,72℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸4 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),擴(kuò)增產(chǎn)物送北京中科希林生物有限公司進(jìn)行純化、克隆及測(cè)序。其中,植物葉片擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序,蜂糧擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆后,每個(gè)樣本隨機(jī)挑選100個(gè)單克隆用于測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

序列分析用軟件Clustal W 2.1[24]進(jìn)行多重序列比對(duì),由Mothur version v.1.30[25]軟件在99 %相似度下進(jìn)行可操作分類單元(OTU)聚類,隨后將OTU的代表序列與已建立的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和分類。最后,統(tǒng)計(jì)蜂糧中各樣本在各個(gè)分類水平上的植物群落組成及豐度。

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。運(yùn)用R軟件的spaa包和vagan包計(jì)算Shannon-wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)；Mothur軟件計(jì)算Chao1指數(shù)。統(tǒng)計(jì)圖由Excel 2007和R軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 序列拼接與組裝

白斑切葉蜂在4個(gè)樣地的2個(gè)主要發(fā)生時(shí)期共采集到29個(gè)筑巢的巢管,解剖后共獲得124個(gè)含有蜂糧的蟲室。從蜂糧的rbcL、trnH-psbA和ITS2基因測(cè)序中獲得優(yōu)質(zhì)序列共2400條。在99%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs共120個(gè)(表1)。

表1 白斑切葉蜂蜂糧樣品和測(cè)序的基本信息

OTU：操作分類單元Operational taxonomic unit；XYSB：新余市水北鎮(zhèn)；JAGP：吉安市戈坪鄉(xiāng)；GZSD：贛州市沙地鎮(zhèn)；GZQYS：贛州市齊云山自然保護(hù)區(qū)

2.2 粉源植物DNA條形碼鑒定

白斑切葉蜂蜂糧的OTU代表序列與專用的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明：rbcL序列比對(duì)后通常會(huì)出現(xiàn)多個(gè)一致性高于99%的物種,而無法準(zhǔn)確鑒定到種。例如,金毛耳草(Hedyotischrysotricha)和攀莖耳草(Hedyotisscandens)序列的一致性為100%。相反,trnH-psbA和ITS2序列雖然也有少數(shù)物種未被鑒定到種,但其鑒定成功率比rbcl更高。3個(gè)基因序列的鑒定準(zhǔn)確率為ITS2>trnH-psbA>rbcL。然而,使用rbcL、trnH-psbA和ITS2序列綜合分析,本實(shí)驗(yàn)中涉及到的OTUs代表序列均能與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的開花植物物種序列相對(duì)應(yīng),物種劃分準(zhǔn)確率為100%,結(jié)果見表 2。

表2 OTUs代表序列與參考數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果

rbcL：編碼核酮糖- 1,5-二磷酸羧化/加氧酶的大亞基Ribulose- 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenas；psbA-trnH：psbA基因和trnH基因的間隔區(qū)序列Intergenic spacer region oftrnHandpsbAgene；ITS2：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Internal transcribed spacer

2.3 粉源植物種類及豐度分析

基于OTUs的分類結(jié)果,對(duì)白斑切葉蜂蜂糧樣本中粉源植物種類和相對(duì)豐度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析(表1)。在科級(jí)分類階元上,共注釋到了菊科(Compositae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、藤黃科(Guttiferae)、豆科(Leguminosae)、唇形科(Labiatae)、馬錢科(Loganiaceae)、錦葵科(Malvaceae)、茜草科(Rubiaceae)和馬鞭草科(Verbenaceae)共9個(gè)科,其中以馬鞭草科植物為優(yōu)勢(shì)類群。在屬級(jí)分類階元上,共注釋到了金合歡屬(Acacia)、藿香薊屬(Ageratum)、鬼針草屬(Bidens)、醉魚草屬(Buddleja)、耳草屬(Hedyotis)、金絲桃屬(Hypericum)、忍冬屬(Lonicera)、鼠尾草屬(Salvia)、黃花稔屬(Sida)和黃荊屬(Vitex)共10個(gè)屬,其中以黃荊屬植物為優(yōu)勢(shì)類群。在種級(jí)分類階元上,共注釋到了兒茶(Acaciacatechu)、金合歡(Acaciafarnesiana)、藤金合歡(Acaciasinuata)、藿香薊(Ageratumconyzoides)、白花鬼針草(Bidensalbavar.radiata)、醉魚草(Buddlejalindleyana)、清遠(yuǎn)耳草(Hedyotisassimilis)、金毛耳草(H.chrysotricha)、地耳草(Hypericumjaponicum)、忍冬(Lonicerajaponica)、藍(lán)花鼠尾草(Salviafarinacea)、佛光草(Salviasubstolonifera)、黃花稔(Sidaacuta)、黃荊(Vitexnegundo)和山牡荊(Vitexquinata)共15個(gè)種。其中以黃荊和山牡荊為優(yōu)勢(shì)種,相對(duì)豐度分別為49.08%和30%。4個(gè)樣地粉源植物種類之間有所不同,XYSB和JAGP均注釋到5種植物,優(yōu)勢(shì)種均為黃荊(分別為69.8%和74%)；GZSD注釋到9種植物,優(yōu)勢(shì)種為山牡荊(54.3%)；GZQYS注釋到12種植物,優(yōu)勢(shì)種為山牡荊(45.8%)和黃荊(26.6%)。4個(gè)樣地的共有優(yōu)勢(shì)種為黃荊(圖2)。

圖2 不同樣地白斑切葉蜂粉源植物組成及相對(duì)豐度Fig.2 Composition and relative abundance of pollen plants of Megachile strupigera from different sample plots

2.4 粉源植物多樣性分析

本研究選擇Chaol、Shannon-wiener和Simpson指數(shù)對(duì)單個(gè)樣本內(nèi)植物種類的豐富度和多樣性進(jìn)行分析。Chaol指數(shù)反映樣本中群落的豐富度,Shannon-wiener指數(shù)反映樣本中群落的多樣性,Simpson指數(shù)反映樣本中優(yōu)勢(shì)種的集中程度。由表3可見,在七月上旬,GZSD和GZQYS的Chao1指數(shù)(分別為9.67±1.15和10.22±0.19)均顯著高于XYSB和JAGP的Chao1指數(shù)(均為5±0.00)；八月中旬,JAGP的Chao1指數(shù)最低(為2±0.00),XYSB和GZSD的Chao1指數(shù)相同(為3±0.00),GZQYS最高(為4±0.00),表明GZQYS具有最高的物種豐富度。GZSD和GZQYS在七月上旬的Shannon-wiener指數(shù)(分別為2.14±0.17和2.41±0.18)均顯著高于XYSB和JAGP的Shannon-wiener指數(shù)(分別為1.55±0.02和1.53±0.06)；八月中旬,GZQYS的Shannon-wiener指數(shù)(1.66±0.05)顯著高于XYSB、JAGP和GZSD(分別為0.91±0.15、0.62±0.25和0.95±0.25),表明GZQYS的物種多樣性最高。Simpson指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與Shannon-wiener指數(shù)統(tǒng)計(jì)的總體趨勢(shì)成反比,表明GZQYS優(yōu)勢(shì)種的集中程度要高于XYSB、JAGP和GZSD。Choal指數(shù)和Shannon-wiener指數(shù)越大,Simpson指數(shù)越小,說明樣本中的物種豐富度和多樣性越高。因此,GZQYS粉源植物的豐富度和多樣性最高,其次是GZSD,較低為XYSB,最低的是JAGP。并且,4個(gè)樣地七月上旬的物種豐富度均明顯要高于八月中旬。

表3 白斑切葉蜂粉源植物的多樣性指數(shù)

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后相同的小寫字母表示樣本間差異不顯著(P> 0.05)

3 討論

DNA條形碼能更精確更迅速的鑒定出蜂糧中的物種組成,且不需要深厚的分類學(xué)研究基礎(chǔ)[17,20]。本研究運(yùn)用該方法能有效鑒定出白斑切葉蜂蜂糧的植物群落組成。然而,不同基因序列的物種鑒定準(zhǔn)確性差異較大。Bruni等[14]認(rèn)為rbcL序列在蜂糧物種鑒定中的能力有限,而trnH-psbA是鑒定準(zhǔn)確性相對(duì)較高的序列。Richardson等[26]認(rèn)為ITS2序列在種內(nèi)和種間變異大,物種正確鑒定率高,具有較高的通用性。本研究,rbcL、trnH-psbA和ITS2在單獨(dú)進(jìn)行物種鑒定時(shí),部分物種不能準(zhǔn)確鑒定到種。而采用rbcL+trnH-psbA+ITS2組合作為蜜蜂蜂糧的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼,能準(zhǔn)確的鑒定蜜蜂蜂糧中植物物種的組成。

本研究使用了克隆測(cè)序的方法來獲取樣本序列,共注釋到粉源植物15種,隸屬于9科,10屬。然而,白斑切葉蜂不同樣地之間的粉源植物豐富度具有一定的差異,尤其是七月上旬GZSD和GZQYS兩個(gè)樣地具有顯著高的物種豐富度。從Chao1指數(shù)分析中可以看出,GZSD和GZQYS樣地中估算的物種數(shù)分別為9.67±1.15和10.22±0.19,而本研究實(shí)際觀察到的物種數(shù)分別只有8和10種。4個(gè)樣地不同時(shí)期的物種豐富度表明,物種注釋數(shù)量的準(zhǔn)確性隨著物種豐富度的增加而降低,一些樣本的實(shí)際物種數(shù)可能會(huì)被低估。另外,本研究并沒有鑒定到何波等[22]之前在野外觀察到的該蜂其他兩種訪花植物(紅根草Lysimachiafortunei和二歧蓼Polygonumdichotomum)。因此,我們認(rèn)為挑取100個(gè)單克隆還不足以完全反應(yīng)出樣本的實(shí)際物種數(shù)量,但這對(duì)其主要OTUs的豐富度和多樣性影響不大。而高通量測(cè)序技術(shù)作為一種主流的研究方法,可更全面提高白斑切葉蜂粉源植物相對(duì)豐度的鑒定準(zhǔn)確率。

傳粉服務(wù)功能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的維持和穩(wěn)定至關(guān)重要,而土地利用方式改變所引起的植物多樣性喪失已成為傳粉者多樣性喪失的主要驅(qū)動(dòng)力之一[27- 28]。蜜蜂作為傳粉昆蟲的重要組成部分,與植物多樣性之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系[29- 32]。本研究發(fā)現(xiàn)不同林地利用方式對(duì)白斑切葉蜂粉源植物多樣性的影響非常明顯。XYSB和JAGP由于人為集約管理程度較高,人為干擾嚴(yán)重,導(dǎo)致粉源植物豐富度和多樣性較低；GZSD由于林區(qū)無人管理,林內(nèi)雜灌木較多,使粉源植物的豐富度和多樣性較高；而GZQYS地處保護(hù)區(qū)內(nèi),人為干擾程度最低,粉源植物組成最為豐富。由此表明,土地利用方式是影響白斑切葉蜂粉源植物多樣性的主要因素,這可能與人為干擾程度有關(guān)。

Requier等[33]研究發(fā)現(xiàn)：受當(dāng)?shù)刂参锷锒鄻有院图竟?jié)性花期變化的影響,蜜蜂在不同時(shí)期或不同世代訪花差異性顯著。本研究通過對(duì)四種不同類型生境下白斑切葉蜂粉源植物組成進(jìn)行分析,均顯示2種黃荊屬植物在該蜂蜂糧中的植物組成中占主導(dǎo)地位,其他植物數(shù)量較少。隨著花期的變化和世代的交替,該蜂訪花植物的種類呈降低的趨勢(shì)。但是,四個(gè)樣地不同時(shí)期的訪花植物種類又存在一定的交叉,且其主要訪花植物都為黃荊屬植物,即該蜂主要粉源植物種類沒有受到花期變化的影響。因此,我們認(rèn)為黃荊和山牡荊是白斑切葉蜂主要的粉源植物,對(duì)維持白斑切葉蜂種群的穩(wěn)定具有重要作用。