劉晨晨，駱海燕，鄶艷榮，高小博，陸彩玲*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100005)

卵巢的主要功能是分泌甾體激素和排卵，其中甾體激素主要是雌激素和孕激素[1]。顆粒細(xì)胞是哺乳動(dòng)物卵泡內(nèi)最大的細(xì)胞群[2]，也是雌激素和孕激素合成的主要場所[3]。雌激素可以促進(jìn)卵泡的生長和排卵，刺激子宮內(nèi)膜增生和血管形成以及維持月經(jīng)周期等[4]。雌二醇(17β-estradiol，E2)是女性生殖系統(tǒng)中活性最強(qiáng)的雌激素[5]。孕酮(Progesterone，P4)是孕激素的主要活性形式，它維持著卵巢月經(jīng)周期和妊娠的正常功能，同時(shí)也是其它許多甾體激素合成的中間體[6]。甾體激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)參與將甾體激素的前體膽固醇由線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，這是孕酮合成的限速步驟。膽固醇在膽固醇側(cè)鏈裂解酶(cytochrome P450scc enzyme，P450scc)的作用下可轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，后者在一系列酶的作用下生成雄激素，而雄激素在芳香化酶(aromatase)的作用下又可生成雌二醇[7-9]。Sirtuin1(Sirt1)是一種組蛋白去乙?；福醒芯堪l(fā)現(xiàn)，Sirt1可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞中孕酮和雌二醇的合成及其關(guān)鍵酶StAR和芳香化酶的表達(dá)[10-11]。

甾體激素合成酶類受體內(nèi)外多種因素的調(diào)節(jié)，其中外源因素包括環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物包括天然和人工合成的化合物，其中很多都有擬雌激素活性[12]。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一種人工合成農(nóng)藥，具有高效、低毒和廣譜等特性，因此成為毒性較強(qiáng)的有機(jī)磷和有機(jī)氯農(nóng)藥的理想替代品。研究表明，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有擬雌激素活性，是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[13]。一些擬除蟲菊酯類農(nóng)藥如氰戊菊酯和聯(lián)苯菊酯會(huì)干擾卵巢內(nèi)甾體激素的合成及關(guān)鍵酶的表達(dá)[14-15]。溴氰菊酯(Deltamethrin，DLT)是一種常見的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，被廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)作物、倉庫等害蟲防治。Camargo-Mathias等[16]發(fā)現(xiàn)DLT可以直接作用于蜱蟲的卵巢。Ge等[17]發(fā)現(xiàn)DLT可以影響半翅目Delphacidae卵巢內(nèi)總RNA和蛋白質(zhì)的合成，抑制產(chǎn)卵。還有報(bào)道稱，在41%的南非的人母乳樣本中檢測到了DLT[18]。但目前還沒有關(guān)于DLT影響卵巢內(nèi)甾體激素合成及關(guān)鍵酶表達(dá)的相關(guān)報(bào)道，因此本研究探討了DLT對(duì)大鼠卵巢和原代顆粒細(xì)胞中甾體激素合成及其關(guān)鍵酶表達(dá)的影響。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：出生21 d的健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級(jí)，體重55～60 g，購自北京維通利華，飼養(yǎng)于國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃，空氣相對(duì)濕度(55±15)%，晝夜周期12/12 h，保證有充足的鼠糧和水。

2.主要試劑和設(shè)備：DMEM/F12液體培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國)；孕馬血清促性腺激素(PMSG，北京海德創(chuàng)業(yè)生物)；溴氰菊酯(天津必斯特化學(xué))；17-β雌二醇、孕酮電化學(xué)發(fā)光法試劑盒(羅氏，美國)；酶標(biāo)儀(Bioteck，美國；Gen5，=450 nm)；StAR和芳香化酶兔多克隆抗體(ABclonal，美國)；P450scc兔多克隆抗體(Cell Signaling，美國)；Sirt1兔多克隆抗體(Santa Cruz，美國)；辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋)。

二、研究方法

1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將21 d齡的雌性SD大鼠按體重區(qū)段隨機(jī)分組法進(jìn)行分組，每組7只，分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組分別給予6.25 mg·kg-1·d-1、12.50 mg·kg-1·d-1DLT(根據(jù)大鼠灌胃的半數(shù)致死量及文獻(xiàn)中DLT的大鼠灌胃劑量[19-21]，我們選擇了這兩個(gè)相對(duì)較低的給藥劑量。)，對(duì)照組給予玉米油。每天灌胃一次，連續(xù)灌胃7 d。于第8天早晨進(jìn)行安樂死，并對(duì)所有大鼠用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后取血，保存于非促凝采血管中，收集卵巢用于后續(xù)提取蛋白。

2.原代顆粒細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：21 d齡的雌性SD大鼠每只腹腔注射20 U的PMSG注射液，飼養(yǎng)48 h后頸椎脫臼處死并在無菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢，剔除卵巢被膜及周圍組織，用1 ml注射器針頭刺破卵泡使顆粒細(xì)胞釋放出來，將顆粒細(xì)胞重懸于含15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并以合適的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以備后續(xù)處理。

3.顆粒細(xì)胞的處理：用二甲基亞砜將DLT溶解配成300 mmol/L的貯存液為母液，依次梯度稀釋成200 mmol/L、100 mmol/L，貯存于-20℃冰箱，分裝備用。待顆粒細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24～48 h后，用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h后，換液，并分別用二甲基亞砜(對(duì)照組)、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L的DLT處理細(xì)胞48 h。

4.電化學(xué)發(fā)光法測定雌二醇和孕酮：收集DLT處理后的大鼠血清和顆粒細(xì)胞上清液，儲(chǔ)存于-80℃，按照雌二醇和孕酮電化學(xué)發(fā)光法試劑盒說明書測定雌二醇和孕酮的水平。

5.組織及細(xì)胞蛋白提?。航M織總蛋白提取時(shí)每0.1 g組織加100 μl裂解液(RIPA、100×PMSF、100×NaF、蛋白酶抑制劑)，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲10～20 s；細(xì)胞總蛋白提取時(shí)需吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，用生理鹽水潤洗細(xì)胞，收集細(xì)胞于滅菌的1.5 ml離心管中，室溫，800 rpm離心，棄去生理鹽水，加適量配好的裂解液裂解蛋白。之后冰上裂解30 min，期間每10 min旋渦震蕩15 s，4℃，13 000 rpm離心15 min，收集上清，分裝，-80℃存放。

6.Western Blot檢測方法：利用BCA蛋白定量試劑盒(Sigma，美國)進(jìn)行蛋白濃度定量，12% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用5%的脫脂牛奶封閉1 h后，分別用一抗4℃孵育過夜，PBST漂洗，隨后用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，PBST漂洗后，ECL化學(xué)顯影。實(shí)驗(yàn)中用β-actin作為內(nèi)參照，利用Image J軟件進(jìn)行灰度定量分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、DLT對(duì)大鼠卵巢內(nèi)甾體激素合成的影響

對(duì)大鼠進(jìn)行了DLT濃度為0、6.25、12.50 mg·kg-1·d-1為期7 d的暴露處理，收集血清，通過電化學(xué)發(fā)光法檢測雌二醇和孕酮水平的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的雌二醇水平升高、孕酮水平下降，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

A：雌二醇；B：孕酮；與對(duì)照組比較，*P**P圖1 DLT暴露7 d后大鼠血清中甾體激素分泌水平的變化

二、DLT對(duì)大鼠卵巢內(nèi)甾體激素合成關(guān)鍵酶及Sirt1表達(dá)的影響

為了檢測DLT暴露處理大鼠，卵巢內(nèi)甾體激素合成關(guān)鍵酶及Sirt1表達(dá)量的變化，我們用Western Blot法對(duì)卵巢組織中StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達(dá)量均顯著升高(P<0.01)，且StAR、P450scc和芳香化酶的表達(dá)量具有劑量依賴性(圖2)。

三、DLT對(duì)原代顆粒細(xì)胞中甾體激素合成的影響

為了進(jìn)一步探究DLT對(duì)顆粒細(xì)胞中甾體激素合成的影響，我們分離了大鼠原代顆粒細(xì)胞，分別用0、100、200、300 μmol/L的DLT處理48 h后，收集上清，通過電化學(xué)發(fā)光法檢測顆粒細(xì)胞中雌二醇和孕酮分泌水平的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中雌二醇水平顯著升高(P<0.001)，孕酮水平?jīng)]有顯著性變化(P>0.05)(圖3)。

A：Western Blot檢測；B：灰度分析柱狀圖；與對(duì)照組比較，*P#P圖2 DLT暴露7 d后大鼠卵巢中StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達(dá)情況

A：雌二醇；B：孕酮；與對(duì)照組比較，*P圖3 DLT處理顆粒細(xì)胞48 h后上清液中甾體激素分泌水平的變化

四、DLT對(duì)原代顆粒細(xì)胞中甾體激素合成關(guān)鍵酶及Sirt1表達(dá)的影響

進(jìn)一步檢測不同濃度DLT(0、100、200、300 μmol/L)處理下，原代顆粒細(xì)胞中甾體激素合成關(guān)鍵酶及Sirt1表達(dá)量的變化，我們用Western Blot法對(duì)顆粒細(xì)胞中StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著DLT濃度的升高，StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達(dá)量均顯著升高(P<0.001)，且具有劑量依賴性(圖4)。

A：Western Blot檢測；B：灰度分析柱狀圖(各處理組4柱自左至右分別示0、100、200、300 μmol/L處理后)；與對(duì)照組比較，*P圖4 DLT處理48 h后顆粒細(xì)胞中StAR、P450scc、芳香化酶及Sirt1的表達(dá)情況

討 論

DLT可以干擾雄性生殖系統(tǒng)，并誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡[20，22]。但目前關(guān)于DLT對(duì)雌性生殖系統(tǒng)影響方面的研究主要以昆蟲為研究材料[16-17]，其對(duì)哺乳動(dòng)物卵巢功能影響方面的研究鮮見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)了DLT可以影響大鼠卵巢內(nèi)甾體激素的分泌及其關(guān)鍵酶的表達(dá)。我們分別進(jìn)行了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探究在DLT暴露下，大鼠卵巢和原代顆粒細(xì)胞中孕酮和雌二醇分泌量的變化，同時(shí)檢測了影響這些甾體激素合成的關(guān)鍵酶StAR、P450scc及芳香化酶表達(dá)量的變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在DLT暴露下孕酮的分泌量減少了，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同時(shí)檢測了控制孕酮合成的關(guān)鍵酶StAR和P450scc表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)隨著DLT暴露濃度的升高，StAR和P450scc表達(dá)量均逐漸增加(P<0.001)。孕酮分泌量變化與其關(guān)鍵酶表達(dá)量變化不一致，這可能是由于孕酮更快地轉(zhuǎn)化成了代謝產(chǎn)物，從而造成檢測到的孕酮水平降低。Nimrod[23]發(fā)現(xiàn)FSH促進(jìn)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中孕酮生成的同時(shí)也激活了一系列促使孕酮代謝的脫氫酶和還原酶。Crellin[24]發(fā)現(xiàn)甲氧滴滴涕抑制豬顆粒細(xì)胞中孕酮生成的同時(shí)，促進(jìn)了P450scc的表達(dá)。同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，雌二醇的分泌量升高了(P<0.05)，這可能是芳香化酶表達(dá)量增加(P<0.001)的原因。體外實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在DLT處理下，大鼠原代顆粒細(xì)胞中孕酮水平基本不變，雌二醇分泌量有升高(P<0.001)，但數(shù)值變化不大。我們還檢測到孕酮合成的關(guān)鍵酶StAR和P450scc表達(dá)量均逐漸增加(P<0.001)，且呈劑量依賴效應(yīng)。雌二醇合成的關(guān)鍵酶芳香化酶的表達(dá)量增加了(P<0.001)。StAR和P450scc表達(dá)量增加幅度較大，而孕酮和雌二醇的變化水平較微弱，這可能是由于DLT同時(shí)促進(jìn)了孕酮和雌二醇的代謝過程，造成檢測到的孕酮和雌二醇的變化水平不大。Chen等[25]發(fā)現(xiàn)三氯生促進(jìn)大鼠原代顆粒細(xì)胞中雌二醇合成酶芳香化酶表達(dá)的同時(shí)，也促進(jìn)了雌二醇代謝酶Cyp1a1和Cyp1b1的表達(dá)?？傊?，DLT對(duì)卵巢甾體激素合成是多因素、多層次的調(diào)節(jié)，雌二醇和孕酮的分泌水平取決于其合成和代謝速率的動(dòng)態(tài)平衡。

Reverchon等[26]發(fā)現(xiàn)內(nèi)脂素可以通過Sirt1來促進(jìn)牛卵巢顆粒細(xì)胞中雌二醇和孕酮的分泌，并且促進(jìn)StAR的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，在DLT處理下甾體激素關(guān)鍵酶StAR、P450scc、芳香化酶表達(dá)量增加的同時(shí)，Sirt1的表達(dá)量也增加了(P<0.01)，這提示DLT可能通過Sirt1來影響甾體激素合成關(guān)鍵酶的表達(dá)及甾體激素的合成。但這還需進(jìn)一步的探索和驗(yàn)證。

綜上，在DLT的暴露下，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中甾體激素合成關(guān)鍵酶StAR、P450scc和芳香化酶表達(dá)量均增加了，同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中孕酮的分泌量減少、雌二醇的分泌量增加，體外實(shí)驗(yàn)中雌二醇的分泌量增加。孕酮對(duì)于腺垂體激素分泌、排卵、孕卵著床和正常妊娠的維持有重要作用，還能促進(jìn)乳腺腺泡的發(fā)育和成熟，它的減少會(huì)影響生殖器官的生長發(fā)育和功能[27]。Vorherr[28]發(fā)現(xiàn)雌二醇的增加會(huì)使下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂、月經(jīng)不調(diào)以及乳腺纖維囊性增生。雌二醇還與一些癌癥如乳腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等的發(fā)生有關(guān)[29-31]。這提示DLT可能會(huì)通過降低孕酮分泌量和提高雌二醇分泌量來干擾雌性生殖系統(tǒng)。本研究在一定程度上為評(píng)估DLT對(duì)女性生殖功能的影響提供了依據(jù)。