朱家紅，劉衛(wèi)衛(wèi)，王江，韓偉，黃國(guó)寧

(重慶市婦幼保健院遺傳與生殖研究所，重慶 400013)

ICSI是治療嚴(yán)重男性不育癥最有效的方式，能夠使受精率大幅提高且臨床結(jié)局得到顯著改善。自ICSI開始應(yīng)用以來(lái)，其使用率不斷增高且應(yīng)用指征也越來(lái)越廣泛[1]。文獻(xiàn)報(bào)道歐洲IVF監(jiān)管中心統(tǒng)計(jì)的2014年39個(gè)國(guó)家1 279個(gè)生殖中心共進(jìn)行了508 433例新鮮周期，其中ICSI占比為71.3%，呈逐年上升趨勢(shì)[2]。此外，ICSI除了廣泛應(yīng)用到男性不育癥的治療外，已擴(kuò)大應(yīng)用到胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)、≥2次輔助生殖技術(shù)(ART)助孕失敗、受精失敗或受精不良、高齡、獲卵數(shù)少等原因引起的不孕癥以及不明原因不孕癥患者。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界均對(duì)ICSI指征是否應(yīng)該擴(kuò)大到這些因素存在較大爭(zhēng)議，有些文獻(xiàn)認(rèn)為ICSI可改善高齡患者的受精率和胚胎質(zhì)量[3]，臨床結(jié)局也更好[4]；然而有些文獻(xiàn)認(rèn)為ICSI不能改善臨床結(jié)局[5]；甚至有些文獻(xiàn)認(rèn)為高齡患者卵母細(xì)胞質(zhì)量較差，ICSI的侵入性操作會(huì)使臨床結(jié)局更差[6]。ICSI對(duì)于高齡非男性因素不孕患者臨床應(yīng)用結(jié)局的影響，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，需要更多的研究來(lái)探討ICSI治療的應(yīng)用范圍。目前比較普遍認(rèn)可將35歲以上的婦女定義為生育高齡婦女，大多數(shù)生殖中心35～37歲婦女ART助孕的成功率呈緩降趨勢(shì)，≥38歲的高齡女性活產(chǎn)率明顯下降，流產(chǎn)率顯著增高。本研究對(duì)高齡(≥38歲)、非男性不孕因素患者行ICSI和常規(guī)IVF助孕的臨床結(jié)局進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探討ICSI的應(yīng)用范圍。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2016～2018年間在重慶市婦幼保健院遺傳與生殖研究所接受ART治療的高齡、非男性因素不孕患者IVF或ICSI的臨床結(jié)局資料。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)行微刺激方案；(2)女性年齡≥38歲；(3)男方精液正常、行IVF或ICSI人工授精的周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：男方精液異常的周期。

精液正常標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)WHO人類精液實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)(第5版)標(biāo)準(zhǔn)提示精液正常且無(wú)抗精子抗體，具體為：濃度>15×106/ml，總活力>40%，前向運(yùn)動(dòng)>32%，正常形態(tài)>4%，體積>1.5 ml。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)受精方式分為ICSI組和IVF組。前次IVF授精無(wú)2PN胚胎故取消周期再次ICSI助孕的納入ICSI組(189例，共334個(gè)周期)；選擇同期、與ICSI組年齡及獲卵數(shù)條件平衡的189例無(wú)受精問(wèn)題取消史的患者為IVF組(共325個(gè)周期)。

2.人工授精及培養(yǎng)：患者接受克羅米芬微刺激促排卵、HCG注射后36 h取卵，將獲得的卵母細(xì)胞培養(yǎng)2～4 h后行人工授精。ICSI授精前脫顆粒，選擇MⅡ期卵母細(xì)胞行ICSI授精。ICSI操作：精子制動(dòng)后吸入注射針，使精子頭部位于注射針尖端，并移入含有卵母細(xì)胞的微滴中，固定針固定卵母細(xì)胞，使第一極體位置位于11～12點(diǎn)位置或者6點(diǎn)位置，注射針穿過(guò)透明帶進(jìn)入卵胞質(zhì)內(nèi)，回吸胞漿液至卵母細(xì)胞破膜后將精子緩慢注入卵母細(xì)胞中心區(qū)域，再緩慢退出注射針。IVF授精：采用50 μl微滴受精法，使用巴斯吸管以約1萬(wàn)條精子/50 μl的密度加精入受精皿微滴中，每微滴加1枚卵母細(xì)胞。受精后18～20 h觀察原核情況，培養(yǎng)至第3天(D3)根據(jù)形態(tài)學(xué)評(píng)估選擇可用胚胎行玻璃化冷凍保存待凍融胚胎移植(FET)備用。

3.觀察指標(biāo)：統(tǒng)計(jì)IVF或ICSI后2PN受精率、優(yōu)胚率、周期取消率及冷凍率，F(xiàn)ET后的流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及新生兒出生結(jié)局。IVF中2PN受精率=D1出現(xiàn)2PN卵子數(shù)/IVF加精卵子總數(shù)×100%；ICSI中2PN受精率=D1出現(xiàn)2PN卵子數(shù)/注射MⅡ卵子總數(shù)×100%；優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%；周期取消率=取消周期數(shù)/采卵周期數(shù)×100%；冷凍率=冷凍胚胎數(shù)/2PN卵裂胚胎數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；早產(chǎn)率=早產(chǎn)(妊娠滿28周至不足37周分娩)周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)×100%；低體重出生率=低體重出生兒(出生時(shí)體重<2 500 g)數(shù)/總出生胎兒數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間均數(shù)比較符合正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者的基本資料比較

ICSI組189例患者共334個(gè)周期，IVF組189例患者共325個(gè)周期；ICSI組女性平均年齡(41.86±2.26)歲(38～52歲)，IVF組女性平均年齡(42.08±2.62)歲(38～51歲)。兩組之間除了ICSI組的不孕年限顯著高于IVF組(P<0.05)外，其余指標(biāo)如平均年齡、體重指數(shù)(BMI)、Gn總量、Gn天數(shù)和獲卵數(shù)比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、兩組患者受精后結(jié)局比較

ICSI組中由于異常卵或未成熟卵取消8個(gè)周期，實(shí)際326個(gè)周期行ICSI。IVF組實(shí)際受精325周期。受精后ICSI和IVF組由于無(wú)2PN胚胎分別取消周期31個(gè)和36個(gè)，由于胚胎質(zhì)量差而無(wú)可移植胚胎分別取消周期44個(gè)和48個(gè)；IVF組由于異常卵或未成熟卵取消7個(gè)周期。ICSI組MⅡ卵率顯著低于IVF組(P<0.05)，但2PN受精率和2PN卵裂率顯著高于IVF組(P<0.05)；兩組的胚胎冷凍率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、取消周期率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 兩組患者的基本資料比較(-±s)

注：與IVF組比較，*P<0.05

表2 ICSI組和IVF組受精結(jié)局比較(%)

注：與IVF組比較，*P<0.05

三、兩組患者FET后臨床結(jié)局比較

成功行FET的ICSI組和IVF組兩組之間的年齡、平均移植胚胎數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；FET后兩組間的著床率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率也均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；ICSI組由于兩例雙胎活產(chǎn)，低體重出生率和早產(chǎn)率均略高于IVF組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 FET后ICSI組和IVF組臨床結(jié)局比較[(-±s)，%]

討 論

本中心對(duì)于女性高齡患者通常采用微刺激方案，由于高齡患者通常卵巢儲(chǔ)備功能低下、獲卵數(shù)少，并且隨著年齡增加卵母細(xì)胞質(zhì)量顯著降低，更容易發(fā)生不受精或異常受精，發(fā)育潛能較低，可利用胚胎數(shù)少，導(dǎo)致臨床結(jié)局差甚至取消周期。因此選擇合適的授精方式，提高正常受精胚胎數(shù)量和質(zhì)量是改善此類患者結(jié)局的關(guān)鍵。

一、ICSI不能排除受精后無(wú)2PN胚胎取消周期的風(fēng)險(xiǎn)

受精過(guò)程機(jī)制復(fù)雜，主要與卵母細(xì)胞的質(zhì)量、精-卵結(jié)合過(guò)程、培養(yǎng)環(huán)境及體外操作相關(guān)。文獻(xiàn)表明男方精液檢查結(jié)果正常的不孕患者將近41%存在精子不能結(jié)合、穿透透明帶或透明帶功能異常[7]。此類患者再次改行ICSI助孕可顯著改善其受精結(jié)局，與本文ICSI組統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致。說(shuō)明ICSI可克服年齡相關(guān)的精卵結(jié)合異常、卵母細(xì)胞透明帶功能異常引起的不受精或多精受精情況，對(duì)于此類患者ICSI是有效的，且本研究結(jié)果顯示ICSI組可獲得的臨床結(jié)局與IVF組無(wú)顯著性差別。本研究結(jié)果顯示IVF組受精后無(wú)2PN胚胎取消周期率為11.08%(36/325)，而ICSI組的為9.28%(31/334)，說(shuō)明ICSI仍不能排除高齡非男性因素不孕患者再次助孕ICSI受精后2PN胚胎取消周期的風(fēng)險(xiǎn)。

二、卵母細(xì)胞質(zhì)量是影響受精的關(guān)鍵

本研究結(jié)果顯示IVF組MⅡ卵率顯著高于ICSI組，但2PN率卻顯著降低，0PN率顯著增高，兩組之間的異常受精率無(wú)顯著性差異?？赡艿脑蚴荌VF組脫顆粒時(shí)間更晚，未成熟的卵母細(xì)胞在期間培養(yǎng)成熟并參與了受精的過(guò)程。文獻(xiàn)表明卵母細(xì)胞成熟度與其受精能力密切相關(guān)，如卵母細(xì)胞中低拷貝數(shù)線粒體DNA、紡錘體功能異常、皮質(zhì)顆粒分布異常以及Ca2+通道異常導(dǎo)致卵母細(xì)胞激活失敗均可導(dǎo)致不受精[8-9]。不成熟的卵母細(xì)胞多精受精率高達(dá)32%～42%，而成熟卵母細(xì)胞發(fā)生率僅6%左右[9]。IVF異常受精最常見的原因是透明帶功能的異常導(dǎo)致多精受精，還可能是精子或卵母細(xì)胞為非單倍體配子。ICSI異常受精主要為單原核合子的形成，即孤雌生殖激活，與卵母細(xì)胞的成熟度以及ICSI操作過(guò)程中Ca2+水平的變化繼發(fā)引起。因此對(duì)于高齡患者改善卵母細(xì)胞質(zhì)量才是影響受精和臨床結(jié)局的關(guān)鍵。

三、ICSI不能改善高齡非男性因素不孕患者的胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局

ICSI為侵入性操作，可能對(duì)胚胎造成損傷影響胚胎發(fā)育[10]，甚至導(dǎo)致卵母細(xì)胞壞死，本研究中ICSI后卵母細(xì)胞壞死率為5.25%(32/610)，其對(duì)胚胎室操作人員技術(shù)要求較高。有文獻(xiàn)認(rèn)為ICSI可提高高齡非男性因素患者的受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎的質(zhì)量[11]，原因是ICSI避免了卵母細(xì)胞與大量精子一起培養(yǎng)的過(guò)程，精子會(huì)產(chǎn)生多種活性氧，這些活性氧與胚胎的損害相關(guān)[12]。但本研究結(jié)果中兩組之間的優(yōu)胚率及胚胎冷凍率無(wú)顯著性差別，ICSI組正常受精率顯著升高的原因可能是ICSI前已排除不成熟的卵母細(xì)胞，這與文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]的受精方式與胚胎質(zhì)量無(wú)關(guān)一致，甚至有文獻(xiàn)表明ICSI用于高齡患者更容易發(fā)生生化妊娠流產(chǎn)[16]，會(huì)導(dǎo)致其臨床結(jié)局更差[5]，相反選擇IVF助孕方式可能更有益于胚胎的發(fā)育[17]。說(shuō)明ICSI并不能改善與年齡相關(guān)卵母細(xì)胞的質(zhì)量下降帶來(lái)的受精失敗或異常受精，不應(yīng)將單純高齡或獲卵數(shù)少作為ICSI的指征。

綜上所述，本研究建議高齡非男性因素不孕患者首次助孕應(yīng)選擇IVF授精方式，而前次無(wú)2PN胚胎取消周期史的患者再次助孕選擇ICSI可以有效改善妊娠結(jié)局。