高 鵬，雒艷萍，李俊峰

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院傳染病研究室，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，甘肅 蘭州 730030)

乙型病毒性肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的以肝臟病變?yōu)橹鞯囊环N傳染病，其嚴(yán)重影響著人類的生命健康[1-2]。目前，全球有3.5～4.0億人感染HBV，抗病毒治療改善患者生活質(zhì)量是全球醫(yī)學(xué)界奮斗的重要任務(wù)[3]。以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)紊亂是乙肝發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。有研究[4-5]顯示：機(jī)體感染HBV后，?？沙霈F(xiàn)T淋巴細(xì)胞及其亞群的紊亂，常表現(xiàn)為CD4+T淋巴細(xì)胞下降，CD8+T淋巴細(xì)胞升高，Th1/Th2淋巴細(xì)胞比例失衡。這種變化常造成細(xì)胞免疫功能不足，機(jī)體免疫功能下降，直接導(dǎo)致病毒清除困難，疾病遷延不愈。但有關(guān)HBV病毒載量高低與T淋巴細(xì)胞及其亞群關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道較少，特別是在不同丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminetransferase， ALT)水平狀態(tài)下兩者之間的關(guān)系目前研究甚少。ALT大于等于正常上限2倍增高，是臨床抗病毒治療乙肝的適應(yīng)證之一。同時(shí)也根據(jù)ALT正常與否，將乙肝感染者分為HBV攜帶者和乙肝患者。研究[3]顯示：HBV在不同ALT水平狀態(tài)下，對機(jī)體的影響不同。但目前以ALT分組探討不同ALT狀態(tài)下HBV對T淋巴細(xì)胞及其亞群影響的文獻(xiàn)報(bào)道少見。本研究探討HBV在不同ALT狀態(tài)下對T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響，旨在闡明以ALT分組抗病毒治療的免疫學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月—2017年12月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院門診和住院確診為慢性乙肝的患者363例，其中男性280例，女性83例，年齡18～60歲。所選患者病例完整，經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后，其中ALT正常組慢性乙肝患者131例(ALT<40 U·L-1)，ALT大于等于正常上限且小于2倍增高組慢性乙肝患者110例(40 U·L-1≤ALT<80 U·L-1)，ALT大于等于正常上限2倍增高組慢性乙肝患者122例(ALT≥80 U·L-1)。并且按HBV載量分為低復(fù)制組(HBV DNA<4.0 lg copies·mL-1)、中復(fù)制組(4.0 lg copies·mL-1≤HBV DNA<6.0 lg copies·mL-1)和高復(fù)制組(HBV DNA≥6.0 lg copies·mL-1)。觀察各組患者不同載量的HBV對T淋巴細(xì)胞總數(shù)、Th/i細(xì)胞數(shù)、Ts/c細(xì)胞數(shù)以及血清中白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)、干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)和白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)水平的影響。同時(shí)對ALT大于等于正常上限2倍增高的慢性乙肝患者給予恩替卡韋(0.5 mg·d-1)治療，隨訪24周，觀察抗病毒治療前后患者機(jī)體病毒學(xué)及免疫功能的改變。慢性乙肝的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《2010年慢性乙型肝炎防治指南》[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)排除妊娠期婦女、中度和重度脂肪肝患者、酒精性肝病患者、藥物性肝損傷患者、自身免疫性肝損傷患者、曾經(jīng)接受過抗病毒治療的患者和并發(fā)其他肝炎感染的患者，以及并發(fā)其他心血管和腎臟等重大臟器病變患者。

1.2 主要儀器

熒光定量PCR分析儀購自德國 Lightcycler ROCH公司，流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)和配套試劑購自美國BD公司，AU400型全自動(dòng)生化分析儀購自日本Olympus公司，XE2100型全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自日本Sysmex公司。

1.3 方 法

1.3.1 乙肝兩對半定量檢測 采集患者靜脈血并分離血清，按羅氏 Cobas e 601 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的操作步驟進(jìn)行定標(biāo)及樣本檢測。

1.3.2 乙肝病毒DNA檢測 采集患者靜脈血并分離血清，按HBV DNA 定量檢測試劑盒和基因擴(kuò)增儀操作步驟進(jìn)行檢測，敏感度 >500 copies·mL-1。

1.3.3 外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 無菌操作采集靜脈血 2～3 mL，EDTA-K2 抗凝，XE2100型全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀進(jìn)行淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測。

1.3.4 CD3、CD4和CD8 單抗標(biāo)記的制備 取100 μL EDTA-K2 抗凝血加入20 μL 三色單克隆抗體(抗 CD3 PE-CY5/抗 CD4-FITC/抗 CD8-PE)，陰性對照取 100 μL EDTA-K2 抗凝血加入20 μL鼠抗人 IgG-PE-CY5/IgG-FITC/IgG-PE，混勻，室溫放置20 min。 加入Muti-Q-Prep 溶血?jiǎng)┨幚?，每份?biāo)本均做測定管和陰性對照管。

1.3.5 T淋巴細(xì)胞分類檢測 流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)開機(jī)預(yù)熱30 min 后，用 Flow-check 熒光微球進(jìn)行光路流路校正，將HPCV 調(diào)節(jié)在 2% 以內(nèi)前向和側(cè)向散射信號(hào)采用線性放大，熒光信號(hào)采用對數(shù)放大，檢測淋巴細(xì)胞表面CD3、CD4和CD8表達(dá)，其陽性表達(dá)以百分率(%)表示。

1.3.6 血清細(xì)胞因子檢測 采集患者靜脈血并分離血清，按IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10檢測試劑盒的操作步驟進(jìn)行ELISA法檢測，檢測患者血清中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 ALT正常組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標(biāo)

在ALT正常組，不同HBV載量患者 T 淋巴細(xì)胞總數(shù)，Th/i淋巴細(xì)胞數(shù)，Ts/c淋巴細(xì)胞數(shù)，血清IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 ALT正常組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標(biāo)

GroupnT lymphocyte(CD3+ )(η/%)Th/i(CD3+ CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+ CD8+)(η/%)IL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)IL-4[ρB/(ng·L-1)IL-10[ρB/(ng·L-1)Low replication4364.28±12.5744.95±8.9521.25±6.7238.29±21.2610.02±3.0143.25±21.5216.27±6.24Middle replication4663.25±11.2745.19±9.2520.62±6.5837.51±19.669.98±3.1244.82±20.4715.58±6.08High replication4262.98±13.5443.68±10.02 19.75±6.2139.64±22.5111.21±3.2740.81±18.9515.23±5.89F0.195 20.264 61.658 30.593 10.726 80.681 70.954 0P0.736 30.623 50.193 70.563 00.325 30.483 90.246 0

2.2 ALT大于等于正常上限且小于2倍增高組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標(biāo)

在ALT大于等于正常上限且小于2倍增高組，隨著HBV載量的增高患者血清IL-2和IFN-γ水平升高(P<0.05)，而其他指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 ALT大于等于正常上限2倍增高組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標(biāo)

在ALT大于等于正常上限2倍增高組，隨著HBV載量的增加，T 淋巴細(xì)胞總數(shù)和Th/i淋巴細(xì)胞數(shù)明顯下降(P<0.05)，Ts/c淋巴細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05)；在Th細(xì)胞亞群方面，隨著HBV載量的增加反映Th1細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)，而反映Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平明顯下降(P<0.05)。見表3。

表2 ALT大于等于正常上限且小于2倍增高組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標(biāo)

GroupnT lymphocyte (CD3+ )(η/%)Th/i(CD3+ CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+ CD8+)(η/%)IL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)]IL-4[ρB/(ng·L-1)]IL-10[ρB/(ng·L-1)]Low replication3858.76±12.8540.22±8.1630.28±5.9641.65±20.2115.87±10.5243.28±17.6517.63±6.91Middle replication3557.93±12.1741.16±8.3531.08±5.8952.46±21.2319.86±11.08844.21±18.9616.51±7.27High replication3758.23±13.3440.46±8.7931.19±5.7157.38±24.5623.93±12.5741.87±18.0616.38±7.08F0.525 40.468 80.312 111.221 710.653 50.319 40.413 6P0.610 00.716 10.736 6<0.01<0.010.735 00.758 2

表3 ALT大于等于正常上限2倍增高組不同HBV載量慢性乙肝患者免疫功能指標(biāo)

GroupnT lymphocyte (CD3+ )(η/%)Th/i(CD3+CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+CD8+) (η/%)IL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)]IL-4[ρB/(ng·L-1)]IL-10[ρB/(ng·L-1)]Low replication3956.19±13.0538.41±6.7934.62±6.8060.57±26.5428.07±14.4738.46±20.5114.15±7.03Middle replication4153.42±11.2335.63±6.2836.92±6.5277.52±30.5135.52±22.5435.06±19.1311.15±7.26High replication4250.01±10.0832.63±6.0838.89±7.0685.84±32.5443.52±26.8132.08±18.339.13±6.54F 11.025 210.354 411.251 69.541 713.582 415.526 48.574 9P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

2.4 ALT大于等于正常上限2倍增高組慢性乙肝患者恩替卡韋抗病毒治療前后病毒學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)

對于ALT大于等于正常上限2倍增高組122例慢性乙肝患者采用恩替卡韋抗病毒治療(0.5 mg·d-1)，治療前后病毒學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)變化進(jìn)行配對t檢驗(yàn)。與治療前比較，治療后患者HBV DNA、HBsAg和HBeAg明顯降低(P<0.05)；HBV DNA完全應(yīng)答率為72.95%，部分應(yīng)答率為89.34%，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為17.07%，有1例患者發(fā)生HBsAg陰轉(zhuǎn)，陰轉(zhuǎn)率為0.82%。見表4。

表4 ALT大于等于正常上限2倍增高組慢性乙肝患者恩替卡韋抗病毒治療前后病毒學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)

“-”:No data.

2.5 ALT大于等于正常上限2倍增高組慢性乙肝患者恩替卡韋抗病毒治療前后免疫學(xué)指標(biāo)

對于ALT大于等于正常上限2倍增高的122例慢性乙肝患者采用恩替卡韋抗病毒治療(0.5 mg·d-1)，治療前后免疫學(xué)指標(biāo)變化進(jìn)行配對t檢驗(yàn)。與治療前比較，治療后患者T 淋巴細(xì)胞總數(shù)和Th/i淋巴細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05)，Ts/c淋巴細(xì)胞明顯下降(P<0.05)。在Th細(xì)胞亞群方面，與治療前比較，患者血清中反映Th1細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ水平明顯下降(P<0.05)，反映Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平明顯升高(P<0.05)。見表5。

表5 ALT大于等于正常上限2倍增高組慢性乙肝患者恩替卡韋抗病毒治療前后免疫學(xué)指標(biāo)

GroupHBV DNA(lg copies·mL-1)T lymphocyte (CD3+)(η/%)Th/i(CD3+CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+CD8+) (η/%)Before treatment6.46±1.9753.35±12.6536.59±6.7936.17±6.12After treatment3.62±1.2061.29±11.6643.46±8.3921.78±7.56t12.305 516.032 117.195 911.531 0P<0.01<0.01<0.01<0.01GroupIL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)]IL-4[ρB/(ng·L-1)]IL-10[ρB/(ng·L-1)]Before treatment78.69±30.2835.07±14.4736.11±20.2512.39±7.01After treatment38.31±20.2410.15±4.7544.80±20.1116.32±6.77t18.542 317.974 415.235 113.710 7P<0.01<0.01<0.01<0.01

3 討 論

HBV感染人體后，可處于不同的免疫狀況，臨床上根據(jù)癥狀、體征和肝功能指標(biāo)，特別是ALT是否正常將其分為HBV攜帶者和乙肝患者，HBV攜帶者多數(shù)無明顯癥狀體征，肝功能輕度受損， ALT多為正?；蜉p度增高[7-8]。而乙肝患者大多出現(xiàn)黃疸、厭食和乏力等癥狀和體征。肝功能嚴(yán)重受損，其中ALT多出現(xiàn)2倍以上增高[9]。同時(shí)ALT大于等于正常上限2倍增高是臨床抗病毒治療乙肝的適應(yīng)證之一。這得到了廣大肝病界專家的共識(shí)，而且也被寫進(jìn)乙肝治療指南中。相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道：HBV感染人體后，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫功能，特別是以T淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫功能有密切聯(lián)系。但是目前很少有文獻(xiàn)以ALT為節(jié)點(diǎn)，探討不同ALT狀態(tài)下HBV對T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響。

本研究結(jié)果顯示：在ALT正常組，不同載量的HBV對T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響無明顯差別，這是因?yàn)樵诖穗A段，多為HBV攜帶者[12]，機(jī)體多數(shù)處于免疫耐受狀態(tài)，HBV在機(jī)體內(nèi)與機(jī)體免疫系統(tǒng)達(dá)成平衡狀態(tài)，不管載量的高低，均未引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，故病毒載量與機(jī)體的免疫細(xì)胞數(shù)量無明顯相關(guān)性[13-14]。當(dāng)然也有可能在此階段，機(jī)體的免疫系統(tǒng)未充分識(shí)別出乙型肝炎病毒，不論載量高低，機(jī)體均未對其做出強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，未能引出強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，因此在此階段病毒載量與免疫效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量上無相關(guān)性[15]。因此對此階段的HBV感染者，臨床上多以密切觀察為主，而不采用抗病毒治療。

而在ALT異常組，特別是ALT大于等于正常上限2倍組中，隨著病毒載量的增加T淋巴細(xì)胞總數(shù)和CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)明顯下降，CD4+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體抗病毒的主要細(xì)胞，CD4+細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，以促進(jìn)特異性B細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)成熟和增殖，具有較強(qiáng)的抗病毒效應(yīng)[16-17]。而在T淋巴細(xì)胞亞群方面，隨著病毒載量的升高，反映Th1細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ水平明顯升高。反映Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平明顯下降。Th1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與病毒清除有關(guān),并同時(shí)與肝組織的病理損傷有關(guān)，Th2細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能抑制Thl細(xì)胞的分化,導(dǎo)致HBV感染的慢性化,又有利于防止Th1細(xì)胞應(yīng)答過度而造成的病理損傷[18-19]。正常機(jī)體Th1/Th2處于相對平衡，互相協(xié)調(diào)，互相制約，而在免疫應(yīng)答階段這種平衡被打破，機(jī)體免疫功能處于紊亂狀態(tài)[20-21]，在本研究中表現(xiàn)為隨著病毒載量的增高，Th1/Th2的平衡被打破，機(jī)體免疫功能處于紊亂狀態(tài)。在此階段，乙肝患者多出現(xiàn)黃疸、厭食和乏力等癥狀及體征。病程遷延不愈，大多與機(jī)體的免疫功能失常有關(guān)。對乙肝患者，臨床上多積極抗病毒治療。

本研究探討了恩替卡韋抗病毒治療24周前后患者病毒指標(biāo)及免疫功能指標(biāo)的變化，恩替卡韋是核苷酸類似物，具有強(qiáng)效的抗病毒治療效果，經(jīng)抗病毒治療24周后，患者HBV DNA明顯清除，機(jī)體獲得了抗病毒治療應(yīng)答，HBeAg明顯陰轉(zhuǎn)，T淋巴細(xì)胞總數(shù)和CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)明顯上升，IL-2和IFN-γ水平明顯下降，IL-4和IL-10水平明顯升高，Th1/Th2的平衡恢復(fù)正常。表明抗病毒治療可以有效地改善患者的免疫功能，HBV載量下降，可以減緩機(jī)體的病理性免疫反應(yīng)，減少對機(jī)體的損傷。

綜上所述，不同的ALT狀態(tài)下，HBV載量高低對機(jī)體免疫功能有不同的影響，并且對于ALT大于等于正常上限2倍增高的乙肝患者積極進(jìn)行抗病毒治療可以明顯改善機(jī)體的免疫狀態(tài)。因此區(qū)分判斷這一點(diǎn)，有助于臨床對病毒免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并采用適當(dāng)?shù)姆绞娇共《局委煛?/p>