洪坡 ，朱東姿，楊曉宏，王甲威*

(1.山東省果樹研究所/農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)果樹科學(xué)觀測試驗站，山東泰安 271000；2.泰安市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局)

甜櫻桃(PrunusaviumL.)近年來種植面積不斷擴(kuò)大，中國現(xiàn)有甜櫻桃栽培面積近20萬hm2(300萬畝)，是甜櫻桃栽培面積最大的國家[1]。但是，由病毒和類病毒引起的甜櫻桃病害在中國櫻桃主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生且呈逐年加重趨勢，已經(jīng)成為影響甜櫻桃產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素[2]。筆者從表型、致病病毒及其基因結(jié)構(gòu)、檢測方法等方面介紹了櫻桃小果病(Little Cherry Disease，LCD)，并提出了防控技術(shù)。

1 櫻桃小果病的發(fā)生及表型

櫻桃小果病是在甜櫻桃和酸櫻桃中均有發(fā)生的一種復(fù)雜而嚴(yán)重的病毒性病害。20世紀(jì)30年代初，在加拿大不列顛哥倫比亞省首次發(fā)現(xiàn)。病果的主要癥狀表現(xiàn)為果實變小、棱狀突起且果頂變尖、不能成熟、著色不良、果實甜度降低、喪失商品價值等(圖1-A，圖1-B)。葉片形態(tài)也發(fā)生改變，表現(xiàn)為皺葉和麻葉表型(圖2-A)，夏末和秋季時，病葉表現(xiàn)出特異的紅色和銅色(圖2-B)。不同品種病樹的癥狀強(qiáng)弱存在差異，但樹勢均會變?nèi)?，并逐步傳播到世界上各個櫻桃產(chǎn)區(qū)[3，4]，多個國家均有報道[5-12]。

2 櫻桃小果病毒及其基因結(jié)構(gòu)

櫻桃小果病的發(fā)生與兩種病毒的感染相關(guān)，分別將其命名為：櫻桃小果病毒1和櫻桃小果病毒2(Little Cherry Virus 1，2，簡寫為LChV-1和LChV-2)。對這兩種病毒及其不同的分離株進(jìn)行了分子鑒定[13]發(fā)現(xiàn)，LChV-1和LChV-2都屬于長線形病毒科(Closteroviridae)，但分屬于不同的屬；LChV-1為隱癥病毒屬(Velarivirus)成員之一[14]，LChV-2因其粉蚧傳播特性，被劃分到葡萄卷葉病毒屬(Ampelovirus)[13]。

圖1 櫻桃小果病毒侵染果實

注：A.櫻桃品種Lambert，B.櫻桃品種Royal Ann。兩圖左側(cè)為感染櫻桃小果病毒2后的櫻桃果實，右側(cè)為健康植株的櫻桃果實(引自Tefera A. Mekuria 等[33]，略有改動)。

注：A.感染櫻桃小果病毒1導(dǎo)致葉片形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)皺葉和麻葉。中間是健康葉片，兩邊是感染病毒病葉片。B左側(cè)為健康植株，右側(cè)為感病植株，表現(xiàn)紅葉癥狀。

LChV-1病毒顆粒形狀為長彎曲桿狀，長度1786～1820nm。對LChV-2病毒顆粒的測量其尺寸為11.2×1667nm[15]。目前已經(jīng)測定了兩種病毒的全基因組序列[13]。通過small RNA測序以及重疊RT-PCR擴(kuò)增等方法，目前在NCBI數(shù)據(jù)庫中共報道了9個LChV-1分離株的全長基因組和4個LChV-2分離株的全長基因組[13,16-19]。

LChV-1及其不同分離株的基因組全長在16880～16963個核苷酸之間，由于不同分離株間進(jìn)化關(guān)系的不同，其分別包含4～5個外顯子和3～4個內(nèi)含子(圖3)。一般包括8個開放閱讀框(ORF)，可能分別編碼木瓜蛋白酶類蛋白酶(papain-like protease，PPRO)、甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase，MET)和解旋酶(helicase，HEL)的保守復(fù)制結(jié)構(gòu)域(ORF1a)，RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp；ORF1b)，一種小的疏水蛋白(smallhydrophobic protein，p4；ORF2)，70kDa的熱休克蛋白同系物(heat-shock protein homologue，HSP70；ORF3)，61kDa的多肽(polypeptide，p61；ORF4)，外殼蛋白(coat protein，CP；ORF5)及次要外殼蛋白(CP minor，CPm；ORF6)和兩個目前功能未知的21kDa多肽(polypeptides，p21；ORF7)和27kDa 多肽(p27；ORF8)。LChV-2及其不同分離株的基因組全長在15031～15425個核苷酸之間，同樣分別包含4～5個外顯子和3～4個內(nèi)含子(圖4)。由于同屬于長線形病毒科，其序列中存在一組保守的核心蛋白編碼序列，包括參與復(fù)制[11]以及編碼木瓜蛋白酶類蛋白酶(PPRO)、甲基轉(zhuǎn)移酶(MET)、解旋酶(HEL)和RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)等，同樣保守的還有病毒外殼蛋白[11]，包括一個小的疏水蛋白、外殼蛋白(CP)、重復(fù)被膜蛋白(CPd)和熱休克蛋白同系物(HSP70)等[20]。

櫻桃小果病的主要致病因子是LChV-2，LChV-1引起的癥狀較輕。目前發(fā)現(xiàn)這兩種病毒僅感染李屬植物，單獨或混合感染都有發(fā)現(xiàn)。一般甜櫻桃感病后的癥狀較為嚴(yán)重，某些酸櫻桃品種也會出現(xiàn)嚴(yán)重的癥狀，幾種觀賞李屬植物感染該病后并不表現(xiàn)癥狀[3]。李、桃和扁桃中都發(fā)現(xiàn)了LChV-1的潛隱感染[12]。LChV-1感染可能導(dǎo)致白普賢櫻(Shirofugen)[21]和關(guān)山櫻(Kwanzan)矮化[22]。Jelkmann等人通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)LChV-1和LChV-2均可感染菟絲子(Cuscutaeuropaea)[3]，并且利用菟絲子成功地將這兩種病毒傳播到西方煙(Nicotiana occidentalis)品種37B上。LChV-2至少可由兩個種的粉蚧進(jìn)行傳播，即蘋果粉蚧(Phenacoccusaceri)和葡萄粉蚧(Pseudococcusmaritimus)[23]。目前并沒有發(fā)現(xiàn)LChV-1的昆蟲介體。兩種病毒都易于嫁接傳播，這可能是傳播介體缺失或群體較少時這兩種病毒的主要傳播方式。

3 櫻桃小果病的檢測方法

鑒定櫻桃小果病的傳統(tǒng)方法為指示植物法，即利用甜櫻桃品種Sam或Canindex I[24]作為指示植物進(jìn)行鑒定，LChV-2分離株能夠?qū)е旅黠@的葉部癥狀，LChV-1導(dǎo)致的癥狀較弱或沒有癥狀。研究人員通過構(gòu)建重組蛋白得到了同時檢測這兩種病毒的抗血清[3]，但該血清僅在加拿大不列顛哥倫比亞省的部分地區(qū)的LChV-2檢測中使用過；還可以采用RT-PCR(實時熒光定量PCR)法檢測這兩種病毒，通過開發(fā)新的引物，能夠更準(zhǔn)確的檢測這兩種病毒[25-28]。但是以上方法均需要對相關(guān)病毒的基本信息有一定的了解，對于一些未知病毒受到極大的限制。隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，small RNA測序成為檢測植物病毒最有效的方法，能夠快速地檢測到樣品中存在的所有病毒，具有更高的靈敏度和信噪比，并且檢測結(jié)果不存在假陽性的問題。隨著測序成本的不斷降低，基于small RNA深度測序技術(shù)逐漸成為檢測植物病毒最準(zhǔn)確、最常用的方法[29]。

4 櫻桃小果病的防控

對櫻桃小果病的防控，主要利用高標(biāo)準(zhǔn)的檢疫程序?qū)γ缒镜纳a(chǎn)和交易進(jìn)行檢測。用于櫻桃果實生產(chǎn)的重要品種原種圃必須經(jīng)過嚴(yán)格的檢測，確保沒有LChV-1和LChV-2感染。如果原種圃植株被這兩種病毒感染，可通過組培脫毒，也可結(jié)合體外化學(xué)藥劑處理脫除[30]。櫻桃苗木應(yīng)選擇無毒苗，并且隨時觀察櫻桃苗的生長狀況，加強(qiáng)對苗圃害蟲防治以及雜草清理工作。當(dāng)苗圃中有粉蚧發(fā)生，應(yīng)及時噴灑殺蟲化學(xué)藥劑進(jìn)行控制。果園應(yīng)該制定應(yīng)對粉蚧發(fā)生處置程序，根據(jù)粉蚧種群和櫻桃小果病的發(fā)生情況，采用不同的處理程序。當(dāng)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)園內(nèi)有疑似感病植株時，應(yīng)及時向有關(guān)專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行咨詢，進(jìn)行專業(yè)的病毒檢測實驗，一旦確定感染櫻桃小果病毒，應(yīng)及時將病樹移除，并在生產(chǎn)園內(nèi)進(jìn)行昆蟲介體的滅殺工作，防止櫻桃小果病毒的傳播與擴(kuò)散，從而將生產(chǎn)園的損失將至最低[31]。