林安憶 潘華鋒 李琰

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的病理類型，占內(nèi)分泌惡性腫瘤的70%以上[1-2]。研究指出，甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生與微小RNA(miRNA)的表達(dá)密切相關(guān)，其中miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455均被證實為甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生的相關(guān)miRNA，其在甲狀腺組織中表達(dá)的上調(diào)與疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3-5]。目前，關(guān)于miRNA的研究多集中于甲狀腺病理標(biāo)本的表達(dá)中，而對于血清miRNA的表達(dá)與疾病的關(guān)聯(lián)性研究較少。本研究對血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的檢測在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的意義進(jìn)行觀察。

對象與方法

一、對象

我院2017年1月～2019年5月收治的甲狀腺乳頭狀癌病人92例，作為研究組，年齡33～65歲，平均年齡(50.93±7.41)歲，男性37例，女性病人55例。對照組92例，為同期正常人群，齡34～62歲，平均年齡(49.18±6.73)歲，男性41例，女性51例。良性組92例，為同期收治的甲狀腺良性腫瘤病人，年齡34～64歲，平均年齡(49.92±7.18)歲，男性39例，女性53例。三組受試對象一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究通過倫理委員會審批。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合美國癌癥聯(lián)合委員會關(guān)于甲狀腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，病理切片檢查確診為甲狀腺乳頭狀癌；(2)甲狀腺乳頭狀癌病人中存在不同的浸潤程度，包括腺外浸潤(腫瘤突破包膜，伴有淋巴管、氣道等侵犯)和腺內(nèi)浸潤(腫瘤局限包膜內(nèi)，不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或器官侵犯)；(3)臨床資料完整；(4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在其他部位原發(fā)性腫瘤；存在心血管、肝、腎等系統(tǒng)嚴(yán)重疾??；隨訪困難或失訪。

二、方法

1.實驗方法：(1)提取RNA樣本：抽取所有受試對象的晨起空腹靜脈血3 ml，以3000 r/min離心15分鐘，取上層血清保存，存于-80℃冰箱，后使用天根生化科技(北京)有限公司miRcutemiRNA試劑盒提取所有樣本中的總RNA，收集所有RNA樣本。(2)引物設(shè)計：miRNA-221引物：上游引物為5′-CGAGACTGTGAGAATTACTTGCAAGCTG-3′、下游引物為5′-CCGCTCGAGCATTGGTGAGACAGCCAATG-3′； miRNA-222引物：上游引物為5′-CGCAGATCTTTTCTTCCACAGA-3′、下游引物為5’-GGGGATCCTCTCAGGACACTGAAGC-3′；miRNA-455引物：上游引物為5′-GGGGGTATGTGCCTTTGGAC-3′、下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6引物：上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物為5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAA -3′。(3)獲取cDNA：按照miScriptIIRT Kit(QIAGEN)試劑盒步驟獲取RNA樣本的cDNA，所有cDNA樣本全部存于-20℃冰箱，統(tǒng)一進(jìn)行后續(xù)檢測。(4)熒光定量PCR：使用賽默飛miRNAqPCR試劑盒進(jìn)行檢測，每個樣本需要在qPCR儀上重復(fù)檢測三次，以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct計算miRNA的相對表達(dá)量。

2.觀察指標(biāo)：(1)比較三組病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表達(dá)情況。(2)比較研究組中不同臨床病理特征病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表達(dá)情況。(3)血清 miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455表達(dá)診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線分析。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

1.三組病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表達(dá)情況比較見表1。結(jié)果表明，研究組病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455表達(dá)均高于對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。良性組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 三組病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表達(dá)情況比較(2-△△Ct)

注：與對照組相比，aP<0.05，bP>0.05

2.研究組中不同臨床病理特征病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表達(dá)情況比較見表2。結(jié)果表明，年齡超過45歲的病人miRNA-455的表達(dá)高于年齡不足45歲的病人，腫瘤直徑超過1 cm的病人miRNA-455的表達(dá)高于腫瘤直徑不足1 cm的病人，單發(fā)病灶病人miRNA-455的表達(dá)顯著高于多發(fā)病人，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人miRNA-221和miRNA-222的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人，出現(xiàn)腺外浸潤的病人miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表達(dá)均顯著高于無腺外浸潤的病人，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455表達(dá)診斷甲狀腺乳頭狀癌ROC曲線分析見表3。結(jié)果表明，miRNA-221、miRNA-222、miRNA-455在甲狀腺乳頭狀癌診斷中均有一定的價值， ROC曲線線下面積(AUC)分別為0.813、0.802、0.794，P值均為0.000。

表2 研究組中不同臨床病理特征病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表達(dá)情況(2-△△Ct)

表3 血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455表達(dá)診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線分析

但是miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455診斷的敏感度和特異度均未>85.0%。

討 論

甲狀腺乳頭狀癌是較常見的內(nèi)分泌腫瘤，其發(fā)病率逐年升高，臨床上常采用穿刺活檢法進(jìn)行診斷，因操作、制作切片技術(shù)及讀片能力會導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)，且屬有創(chuàng)操作，病人不易接受。也有甲狀腺乳頭狀癌血清腫瘤標(biāo)志物診斷效能的報道[7-8]，但各項指標(biāo)的特異性較差，目前臨床上還未發(fā)現(xiàn)一種高靈敏度、高特異度標(biāo)志物來診斷甲狀腺乳頭狀癌。近年來，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455均是腫瘤特異標(biāo)志物，在癌組織中的表達(dá)存在明顯異常[9-11]。本研究旨在探討血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的檢測在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的臨床意義。

本研究結(jié)果表明，研究組病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455表達(dá)均高于對照組，良性組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。miRNA作為一類廣泛存在于人體的單鏈非編碼RNA，在基因表達(dá)調(diào)控中有重要作用，通過和mRNA互補結(jié)合，使得轉(zhuǎn)錄翻譯水平發(fā)生抑制，或直接調(diào)節(jié)mRNA的活性，改變其生理功能[12]。與在甲狀腺乳頭狀癌病人病變組織中的結(jié)果一致[13-14]，病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表達(dá)明顯上調(diào)，也發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)的差異性。血清miRNA檢測在甲狀腺乳頭狀癌診斷中有一定的價值，操作方便易行，病人痛苦小，病人容易接受。研究還發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌病人中，年齡超過45歲、腫瘤直徑超過1cm、單發(fā)病灶、存在腺外浸潤的病人血清miRNA-455的表達(dá)升高；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腺外浸潤的病人血清miRNA-221和miRNA-222的表達(dá)升高。miRNA-455在甲狀腺乳頭狀癌癌組織中的表達(dá)上調(diào)和病人TNM分期密切相關(guān)，同時也與腫瘤直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，血清miRNA的異常則與病人年齡、腫瘤病灶情況以及腫瘤轉(zhuǎn)移情況有相關(guān)性，其在ROC曲線分析中的敏感度和特異度均較差，AUC僅為0.794，整體診斷效能并不理想。miRNA-221和miRNA-222可能通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑以增強癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，miRNA-221還可抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白p27Kipl的表達(dá)，p27Kipl在細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控中具有關(guān)鍵作用，強制表達(dá)miRNA-221和miRNA-222可以刺激甲狀腺癌細(xì)胞打破G1/S周期停滯，從而持續(xù)增殖。miRNA-221和miRNA-222是目前多種惡性腫瘤的治療靶點，其在肝癌、膠質(zhì)瘤等多種癌癥中均存在異常的表達(dá)，既往研究提示上述兩種miRNA也可作為甲狀腺乳頭狀癌的治療靶點，同時與腫瘤的侵襲性存在一定的相關(guān)性[15]。本研究也提示，血清miRNA-221和miRNA-222與病人腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤存在一定的相關(guān)性，在診斷甲狀腺乳頭狀癌時，上述兩種miRNA的AUC分別為0.813和0.803，其中miRNA-221的診斷靈敏度和特異度更好，整體的診斷效能要優(yōu)于miRNA-455，在臨床診斷中能夠幫助判斷病人腫瘤轉(zhuǎn)移情況和浸潤情況，有利于臨床分期，但對腫瘤直徑和病灶個數(shù)無明顯的提示作用。本研究顯示，血清miRNA-221和miRNA-222在判斷甲狀腺乳頭狀癌方面有一定的價值，但靈敏度和特異度不高。由于本研究為單中心研究，病人的樣本量有限，而影響miRNA表達(dá)以及檢測準(zhǔn)確性的因素較多。因此，血清miRNA能否作為甲狀腺乳頭狀癌診斷的標(biāo)準(zhǔn)或?qū)膊≡\斷的具體效果需要大樣本進(jìn)一步的分析和驗證。

綜上所述，血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌病人中有明顯的上調(diào)，通過檢測miRNA能夠初步判斷病人腫瘤病灶情況、轉(zhuǎn)移情況以及浸潤程度，為臨床甲狀腺乳頭狀癌診斷提供一種有效的輔助檢查手段。但其診斷的靈敏度、特異度和臨床意義仍需要進(jìn)一步的研究。