張致呈,劉 燕,趙志剛,李貴文

（皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

亞側(cè)耳,又叫做元蘑(產(chǎn)地黑龍江一帶）、冬蘑、黃蘑,形似扁狀半圓形和腎臟形,以黃綠色為主,有一定粘度。亞側(cè)耳主要生長(zhǎng)在腐爛的闊葉樹(shù)中,分布在北方、川藏地區(qū),是一種木腐朽菌,可以食用[1]。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為,亞側(cè)耳性甘、溫和,可以祛火清熱,排除濕氣,在治療肝硬化、癲癇等方面有顯著效果,同時(shí)還能夠減輕肌肉疼痛,消除眼睛紅腫、脹痛等病癥[2]。多糖是亞側(cè)耳的主要成分,也是有藥用價(jià)值的部分,亞側(cè)耳多糖一方面可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞,另一方面還可以免疫調(diào)節(jié)人體。亞側(cè)耳多糖能夠降低輻射所致的免疫功能損傷影響,而且還能增強(qiáng)機(jī)體的防御能力,同時(shí)還能降低和修復(fù)化療藥物對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的破壞,起到增效減毒的作用,它體現(xiàn)了中醫(yī)的精髓[3-4]。目前,關(guān)于亞側(cè)耳的研究多集中于藥理方面,而在提取工藝方面的研究較少,本次試驗(yàn)首次采用正交設(shè)計(jì)對(duì)微波輔助提取亞側(cè)耳多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,為亞側(cè)耳活性多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

RE5298標(biāo)準(zhǔn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；MD6A微波樣品處理系統(tǒng),北京盈安美誠(chéng)科學(xué)儀器有限公司；UV-5100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海元析第三分析儀器廠(chǎng)；AB104-N電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司。

亞側(cè)耳(購(gòu)于毫州藥材市場(chǎng)）；95%乙醇、葡萄糖、濃硫酸、氯仿、正丁醇、苯酚、無(wú)水乙醇等均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖含量的檢測(cè)

用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,采用硫酸—苯酚法進(jìn)行檢測(cè)[5]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

取六只50 mL容量瓶,將已經(jīng)烘干過(guò)的葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品配置所需要的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取 0 mL、3 mL、6 mL、9 mL、12 mL、15 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液加入容量瓶中,分別添加一定量蒸餾水定容搖勻。從上面得到的六只容量瓶中各自取1 mL溶液加入試管中,依次將0.6 mL 5%的苯酚溶液和3 mL濃硫酸加入試管中,振蕩使它們充分混合均勻,然后把試管放入60℃水中開(kāi)始恒溫反應(yīng)20 min,等待反應(yīng)完畢后,停止加熱,將試劑冷卻至室溫,把試劑樣品放入分光光度計(jì),選擇波長(zhǎng)為490 nm進(jìn)行吸光度測(cè)量,結(jié)合測(cè)量數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到如下回歸方程:

式中:A——吸光度

C——葡萄糖濃度, μg/mL

1.2.3 微波輔助萃取方法

將亞側(cè)耳原材料干燥后粉碎經(jīng)石油醚、乙醇脫脂,然后乙醇提取,去除其中的醇溶性雜質(zhì)和單糖,過(guò)濾后殘?jiān)栏蓚溆?稱(chēng)取5 g除脂后的亞側(cè)耳粉,加入規(guī)定用量的溶劑,靜置一定時(shí)間潤(rùn)濕物料,然后恒溫條件下微波提取一定時(shí)間,累計(jì)提取兩次,抽濾提取劑,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到原體積的1/5左右,除去蛋白質(zhì),醇沉后用無(wú)水乙醇淋洗,取出干燥得粗多糖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

觀察圖1中曲線(xiàn)走勢(shì),不難發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度等其他因素保持不變時(shí),微波提取時(shí)間不斷變大,曲線(xiàn)持續(xù)上升,提取得率也在上升,提取時(shí)間到達(dá)10 min時(shí),提取得率也隨之到達(dá)最大值,發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間超過(guò)10 min后,如果繼續(xù)提取,時(shí)間并不影響亞側(cè)耳多糖的提取得率,時(shí)間越長(zhǎng)反而有所下滑,說(shuō)明此時(shí)多糖已經(jīng)基本完全溶解提取,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)多糖發(fā)生其他反應(yīng)分解。因此10 min是多糖最佳的微波提取時(shí)間。

圖1 提取時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on yield

2.1.2 液料比對(duì)得率的影響

圖2 液料質(zhì)量比對(duì)提取得率的影響Fig.2 Effect of liquid mass ratio on extraction yield

觀察圖2,當(dāng)提取時(shí)間等其他條件保持不變時(shí),當(dāng)液料比逐漸上升的時(shí)候,亞側(cè)耳多糖的得率也逐漸提高,在液料比為30∶1的時(shí)候達(dá)到最大值,繼續(xù)增加液料比得率基本不變甚至有所下降,可能是液體量太多影響結(jié)果。因此經(jīng)過(guò)多種考慮選擇30∶1的液料比最佳。

2.1.3 提取溫度對(duì)得率的影響

根據(jù)圖3曲線(xiàn)走勢(shì)不難發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度為70℃時(shí)得率為峰值,表示此溫度下多糖基本被全部提取。溫度過(guò)高得率下降可能是多糖在高溫下發(fā)生分解。因此微波提取的最佳溫度為70℃。

圖3 提取溫度對(duì)提取得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)得率的影響

由圖4曲線(xiàn)走勢(shì)可知,當(dāng)提取次數(shù)為2時(shí),得率已經(jīng)接近最大值,次數(shù)增加得率緩慢上升后基本不變,表明提取兩次已基本提取完全。因此微波提取的最佳提取次數(shù)為2。

圖4 提取次數(shù)對(duì)得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on yield

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factor level of experiment

為了優(yōu)化微波提取工藝,了解各因素之間相互關(guān)系和影響范圍。將溫度(A）、亞側(cè)耳多糖的液料比(B）、亞側(cè)耳多糖的微波提取次數(shù)(C）、亞側(cè)耳多糖的提取時(shí)間(D）四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),選擇使用L9(34）正交表。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和正交表,判斷提取得率和它們的關(guān)系,明確了影響因素的優(yōu)先級(jí)順序:A＞D＞C＞B,同時(shí),聯(lián)系社會(huì)生產(chǎn)實(shí)際過(guò)程,得到最佳提取工藝條件為 A3B3C2D2。即:設(shè)置提取溫度為80℃,將亞側(cè)耳多糖的液料比確定在35∶1,分別提取兩次,每次都提取10 min,此時(shí)提取效果最佳。同時(shí)為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,以正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝條件為基礎(chǔ)進(jìn)行平行試驗(yàn),計(jì)算得率的平均值,結(jié)果為15.16%。由此可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可以再現(xiàn)的,有效的。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment chart and result

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在溫度為80℃條件下,對(duì)液料比為35∶1的亞側(cè)耳重復(fù)提取兩次,每次10 min,此時(shí)的得率最高。相比傳統(tǒng)方法,微波提取技術(shù)有效提升了亞側(cè)耳多糖的提取率,同時(shí)可以縮短提取時(shí)間,簡(jiǎn)化提取工藝,在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中有一定指導(dǎo)作用。