姜輝,劉濤,楊忠路,葛玉光,都業(yè)君
(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管外科,沈陽 110016)
急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是最常見的心血管疾病,發(fā)病率和死亡率都很高[1]。溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等再灌注治療被認(rèn)為是降低AMI死亡率的有效措施。目前,臨床上廣泛使用靜脈注射溶栓藥物,但出血等不良反應(yīng)不容忽視。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)可避免介入性血管重建引起的出血,但不能促進(jìn)心臟再生,也不能避免心肌細(xì)胞損傷[2-3]。因此,尋找保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧損傷的新的治療策略具有重要的意義。
齊墩果酸(oleanolic acid,OA)是一種生物活性五環(huán)三萜類植物化學(xué)物質(zhì),常見于橄欖科植物。OA具有多種潛在的藥理作用,例如對(duì)化學(xué)或果糖誘導(dǎo)的肝損傷保護(hù)作用以及抗炎、抗糖尿病、抗氧化、抗腫瘤和抗糖苷作用等,且未見合成藥劑的常見不良反應(yīng)[4-5]。還有研究[6]發(fā)現(xiàn),OA對(duì)于高糖誘導(dǎo)的心肌損傷具有一定保護(hù)作用,但是其具體機(jī)制尚不明確。
本研究擬探討OA對(duì)缺氧損傷大鼠心肌細(xì)胞H9C2增殖、凋亡和遷移的潛在作用及其可能的機(jī)制,旨在為臨床上心肌梗死的治療提供可能的新方法。
大鼠心肌H9C2細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)。OA購自美國(guó)Selleck生物科技有限公司,DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶購自武漢普諾賽生命科技有限公司,Annexin-PI染液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,MTT購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,NP-40裂解液購自北京天根生化科技有限公司,MEK抗 體、p-MEK抗 體、Cyclin D1抗 體、bcl-2抗 體、MMP2抗體和GAPDH抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與缺氧模型構(gòu)建:將H9C2細(xì)胞接種于96孔板中(1×103/孔)。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2(95%空氣)飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)H9C2細(xì)胞,設(shè)為常氧對(duì)照組;另在1%O2、5%CO2和94%N2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2細(xì)胞,設(shè)為缺氧模型組,每組3個(gè)復(fù)孔。
1.2.2 藥物處理:將OA溶解于0.9%NaCl溶液,制成20 mol/L原液。將H9C2細(xì)胞接種于96孔板中(1×103/孔),缺氧孵育12 h后,分別加入0.9%NaCl溶液(對(duì)照組)以及不同濃度的OA,藥物終濃度為25和50 μmol/L,每組3個(gè)復(fù)孔。
1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn):分別在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)0、12、24、36和48 h時(shí),以及藥物處理0、12、24、36和48 h時(shí),向96孔板中加入MTT(5 mg/mL),37 ℃ 孵育4 h。棄上清液,加入MTT-甲臜結(jié)晶,用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度。
1.2.4 流式細(xì)胞術(shù):不同濃度(終濃度25和50 μmol/L)OA作用細(xì)胞24 h后,用胰蛋白酶消化,制成單細(xì)胞懸液,加入預(yù)冷的70%乙醇固定過夜。800 r/min離心5 min,棄上清,加入50 μL Annexin-PI染色液并充分混勻,37 ℃ 避光染色30 min,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。
1.2.5 transwell實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞接種于transwell小室中(1×105/孔),下室加入600 μL含血清培養(yǎng)基,12 h后更換培養(yǎng)基,用不同濃度OA(終濃度為25和50 μmol/L)處理細(xì)胞,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。16 h后,用棉簽擦去上層細(xì)胞,95%乙醇固定20 min,0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色20 min。200倍顯微鏡下觀察。
1.2.6 Western blotting:用不同濃度OA(終濃度為25和50 μmol/L)處理細(xì)胞24 h后,用NP-40制備細(xì)胞裂解液。取30 μg蛋白行SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,TBST漂洗,5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入一抗(MEK抗體1 ∶800稀釋,p-MEK抗體1 ∶800稀釋,Cyclin D1抗體1 ∶1 000稀釋,bcl-2抗體1 ∶1 000稀釋,MMP2抗體1 ∶1 000稀釋,內(nèi)參照GAPDH抗體1 ∶5 000稀釋),4 ℃ 孵育過夜。洗膜,加入二抗孵育1 h。采用ECL發(fā)光法檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,缺氧模型組H9C2細(xì)胞的增殖受到抑制,與常氧對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),見圖1、表1。
transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與常氧對(duì)照組(54.69±6.78)比較,缺氧模型組H9C2細(xì)胞的遷移能力(37.45±5.23)受到抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2。
MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,25 μmol/L和50 μmol/L OA可以促進(jìn)缺氧H9C2細(xì)胞的增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),見圖3、表2。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,OA能夠有效阻滯H9C2細(xì)胞的凋亡(25 μmol/L和50 μmol/L OA 組分別為8.63%±2.74%和4.28%±1.12%),與對(duì)照組(12.72%±1.67%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),見圖4。transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)OA處理的缺氧H9C2細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)(25 μmol/L和50 μmol/L OA 組分別為52.41±6.98和61.44±8.02),與對(duì)照組(31.16±5.77)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),見圖5。
表1 缺氧對(duì)H9C2細(xì)胞增殖能力的影響(OD490nm)Fig.1 Effects of hypoxia on the proliferation of H9C2 cells(OD490nm)
圖1 缺氧對(duì)H9C2細(xì)胞增殖的影響(n=3)Fig.1 Effects of hypoxic on the proliferation of H9C2 cells(n=3)
圖2 缺氧對(duì)H9C2細(xì)胞遷移的影響 ×200Fig.2 Effect of hypoxic on H9C2 migration ×200
Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,OA處理H9C2細(xì)胞24 h后,MEK磷酸化水平以及Cyclin D1、bcl-2、MMP2蛋白表達(dá)水平明顯升高,見圖6。
研究[7]表明,OA可以通過減弱高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和降低缺血再灌注后蛋白酶活性,對(duì)大鼠心肌發(fā)揮保護(hù)作用。本研究觀察了OA對(duì)缺氧H9C2細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,并進(jìn)一步探索其作用機(jī)制,以期能夠?yàn)榕R床上心肌梗死的治療提供新的可能。
表2 OA對(duì)缺氧H9C2細(xì)胞增殖能力的影響(OD490nm)Fig.2 Effect of OA on proliferation of hypoxia H9C2 cells(OD490nm)
圖3 不同濃度OA對(duì)H9C2細(xì)胞增殖的影響(n=3)Fig.3 Effect of different concentrations of oleanolic acid on H9C2 proliferation(n=3)
心肌梗死的發(fā)病機(jī)制涉及多種信號(hào)通路,其中MEK/ERK和AMPK信號(hào)通路在心肌缺血再灌注損傷中起重要作用。其中,MEK/ERK在心肌缺血再灌注應(yīng)激中的作用目前尚有爭(zhēng)議,大多數(shù)認(rèn)為MEK/ERK通路的激活具有心肌保護(hù)作用[8],增強(qiáng)MEK/ERK的激活可減少心肌梗死面積[9]。本研究結(jié)果表明缺氧能夠抑制H9C2細(xì)胞的增殖和遷移,與前人的研究結(jié)果一致。
圖4 不同濃度OA對(duì)缺氧H9C2細(xì)胞凋亡的作用Fig.4 Effect of different concentrations of oleanolic acid on apoptosis of H9C2 cells after hypoxia
圖5 不同濃度OA對(duì)缺氧H9C2細(xì)胞遷移的作用 ×200Fig.5 Effect of different concentrations of oleanolic acid on migration of H9C2 cells after hypoxia ×200
圖6 OA對(duì)H9C2細(xì)胞增殖、凋亡及遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of oleanolic acid on the expression of proteins related to the proliferation,apoptosis,and migration of H9C2 cells
研究[10]表明,OA具有多種藥理作用,包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化、抗炎和抗癌等?;谶@些藥理作用,OA已被證明在細(xì)胞保護(hù)和器官保護(hù)方面是有益的。本研究在構(gòu)建缺氧心肌細(xì)胞模型后,用不同濃度的OA處理缺氧的H9C2細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),OA能促進(jìn)H9C2細(xì)胞的增殖,而且這種促進(jìn)作用具有劑量依賴性。進(jìn)一步的研究證明,OA還能夠抑制缺氧H9C2細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)缺氧H9C2細(xì)胞的遷移。研究[8]表明,MEK信號(hào)通路參與調(diào)控缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移能力下調(diào),其下游的Cyclin D1作為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要蛋白,具有促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)化的作用,bcl-2蛋白能夠阻止細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),從而抑制細(xì)胞凋亡,MMP2能夠通過降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡,發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的作用。本研究通過Western blotting發(fā)現(xiàn)OA可促進(jìn)缺氧H9C2細(xì)胞MEK的磷酸化水平,但并不影響總MEK的表達(dá);另外,OA還促進(jìn)了Cyclin D1、bcl-2和MMP2的表達(dá)。因此,推測(cè)OA通過以上作用促進(jìn)缺氧H9C2細(xì)胞的增殖和遷移,并抑制其凋亡,進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的功能。
綜上所述,本研究結(jié)果表明,OA能夠?qū)θ毖鯎p傷后的大鼠心肌H9C2細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用,提示OA可能成為臨床上治療心肌梗死的潛在藥物。
中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2020年3期