鄭啟智，趙勁博，盛偉偉，周建平，董明

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科/疝外科，沈陽 110001）

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤和癌癥相關(guān)死亡原因之一，目前在全世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率仍較高［1］。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多階段、長期形成的復(fù)雜病變過程，局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的最重要因素［2］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為是影響結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的重要作用機(jī)制之一。生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等介導(dǎo)EMT的發(fā)生，同時(shí)TGF-β、Wnt、Notch等多種信號(hào)通路相互交錯(cuò)調(diào)控EMT的過程［3］?？缒さ鞍祝╰ransmembrane protein，TMEM）家族成員被證實(shí)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［4-5］。而本課題組前期研究［6］表明，TMEM206過表達(dá)可通過與AKT和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)通路相互作用，促進(jìn)結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展。本研究的目的是探討TMEM206影響結(jié)直腸癌EMT的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480（中科院上海細(xì)胞庫），TMEM206兔抗人多克隆抗體（英國Abcam公司），pCMV6、pCMV6-Myc-DDK-206（RC202838）（美國OriGene公司），Lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司），PVDF膜（美國Millipore公司），p-ERK和c-Myc抗體（美國Cell Signaling Technology公司），纖連蛋白（Fibronectin）、Zeb1、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Snail1、Snail2和β-actin抗體（美國Proteintech公司），二抗（中國中杉金橋），IgG抗體（美國Santa Cruz公司），磁珠（美國Bio-Rad公司），EGF（美國Proteintech公司），牛血清白蛋白（美國Sigma公司），24孔板（美國Corning Costar公司），基質(zhì)膠（美國BD Biosciences公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HCT116、SW480細(xì)胞均使用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和100 IU/mL青-鏈霉素），置于37 ℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，隔天消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用Lipofectamine 3000等相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑作為溶液，分別使用TMEM206質(zhì)粒和NC-PCMV6空載質(zhì)粒對HCT116、SW480細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分為TMEM206（206組）和對照組（NC組）。將2種細(xì)胞接種至6孔板后，在細(xì)胞密度約為60%時(shí)，將相容的質(zhì)粒和Lipofectamine 3000、p3000加入，細(xì)胞培養(yǎng)8 h后用于其他實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 EMT構(gòu)建：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的2種細(xì)胞用50 ng/mL EGF在48～72 h內(nèi)處理2次。使用1%牛血清白蛋白為對照，分為NC組、206組、NC+EGF組和206+EGF組，用含有1%胎牛血清的推薦生長培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，以增強(qiáng)EGF的作用。

1.2.4 Western blotting：收集進(jìn)行上述EMT構(gòu)建后的HCT116、SW480細(xì)胞，提取總蛋白。通過10% SDSPAGE分離樣品蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。然后將膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h。與TMEM206、p-ERK、c-Myc、Fibronectin、Zeb1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail1、Snail2和β-actin抗體在4 ℃孵育過夜。之后將膜與二抗在室溫下孵育2 h。ECL發(fā)光方法檢測蛋白條帶，運(yùn)用Image J軟件分析各條帶灰度值。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell實(shí)驗(yàn)）：在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞侵襲和遷移測定。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的密度調(diào)整為2×105/孔，將上述EMT構(gòu)建中的NC組、206組、NC+EGF組 和206+EGF組 的HCT116及SW480細(xì)胞接種到小室中。將300 μL細(xì)胞懸液接種到上室中，下室中加入600 μL含有20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。侵襲實(shí)驗(yàn)中上室用200 mg/mL基質(zhì)膠包被，其余同遷移實(shí)驗(yàn)，37 ℃下孵育3 h后進(jìn)行侵襲測定。24 h后取出小室，冰甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。每孔任意選取3個(gè)視野（200×）獲得細(xì)胞圖像。結(jié)果表示為每個(gè)視野遷移的細(xì)胞數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 免疫共沉淀：TMEM206質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以增加其表達(dá)。48 h后提取蛋白。將質(zhì)粒標(biāo)簽Myc-tag和IgG抗體與磁珠室溫孵育1 h后，將磁珠與樣品蛋白在4 ℃孵育過夜。煮沸樣品后用于SDS-PAGE，然后進(jìn)行Western blotting分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均通過3次以上的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得。Western blotting、細(xì)胞遷移和侵襲測定結(jié)果用±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMEM206過表達(dá)促進(jìn)EGF誘導(dǎo)的EMT樣細(xì)胞形態(tài)

EGF誘導(dǎo)后，HCT116和SW480細(xì)胞均表現(xiàn)出EMT樣細(xì)胞形態(tài)：大多數(shù)細(xì)胞喪失其上皮特征并呈現(xiàn)紡錘形和成纖維細(xì)胞樣形態(tài)（圖1）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，TMEM206上調(diào)增強(qiáng)了EGF誘導(dǎo)的EMT樣細(xì)胞形態(tài)。大多數(shù)HCT116細(xì)胞中，206+EGF組細(xì)胞較206組細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞形態(tài)改變，紡錘形和成纖維細(xì)胞樣形態(tài)更為顯著（圖1）。SW480細(xì)胞中，這種促進(jìn)作用更為明顯。

2.2 TMEM206過表達(dá)促進(jìn)EGF誘導(dǎo)2種結(jié)直腸癌細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

圖1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、EGF處理后結(jié)直腸癌細(xì)胞的形態(tài) ×100Fig.1 Cell morphology of plasmid-transfected colorectal cancer cells after EGF treatment ×100

對比2種細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的NC組、206組、NC+EGF組和206+EGF組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGF顯著誘導(dǎo)2種細(xì)胞中E-cadherin減少以及Fibronectin、Vimentin、Zeb1、N-cadherin、Snail1、Snail2蛋白增加。然而，TMEM206過表達(dá)部分促進(jìn)了EGF誘導(dǎo)的EMT相關(guān)蛋白變化，包括促進(jìn)EGF誘導(dǎo)的E-cadherin減少以及Fibronectin、Zeb1、Snail1、Snail2蛋白增加（Vimentin和N-cadherin除外）。見圖2。

2.3 TMEM206過表達(dá)在2種結(jié)直腸癌細(xì)胞中促進(jìn)EGF激活的ERK/MAPK-cMyc信號(hào)傳導(dǎo)

EGF在HCT116和SW480細(xì)胞中顯著激活ERK/MAPK-cMyc信號(hào)傳導(dǎo)，隨后pERK和c-Myc蛋白表達(dá)增加（圖2）。無EGF刺激下，單獨(dú)TMEM206過表達(dá)不影響相關(guān)蛋白表達(dá)。然而，TMEM206過表達(dá)促進(jìn)了EGF誘導(dǎo)的pERK和c-Myc蛋白增加（圖2）。上述結(jié)果提示，TMEM206和ERK/MAPK-cMyc信號(hào)通路特異性相互作用。

另外，TMEM206過表達(dá)部分上調(diào)EGFR-ERK/MAPK-c-Myc信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白，包括Fibronectin、c-Myc和p-ERK（圖2）。接下來，通過免疫共沉淀測定來證實(shí)這些結(jié)果。結(jié)果顯示，TMEM206與c-Myc和E-cadherin免疫共沉淀（圖3）。但TMEM206并不與ERK直接結(jié)合，這與之前的共沉淀結(jié)果一致。結(jié)果表明，結(jié)直腸癌細(xì)胞中TMEM206和EGF誘導(dǎo)的EGFR-ERK/MAPK-c-Myc信號(hào)通路之間相互作用。

2.4 TMEM206過表達(dá)促進(jìn)EGF增強(qiáng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移

EMT在結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，EGF能夠顯著增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，TMEM206過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后的206組細(xì)胞，其侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)。同時(shí)，TMEM206過表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)了EGF增強(qiáng)的細(xì)胞侵襲和遷移。EGF誘導(dǎo)后，與NC+EGF組相比，206+EGF組中細(xì)胞侵襲和遷移明顯增加。結(jié)果提示，TMEM206過表達(dá)促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞中EGF誘導(dǎo)的EMT。在SW480細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。見圖4。

3 討論

TMEM206是TMEM家族成員，在神經(jīng)、腎臟和腸道組織中高度表達(dá)。之前的研究［6］表明，TMEM206在結(jié)直腸癌組織中上調(diào)，其表達(dá)與T分期和UICC分期呈正相關(guān)，與結(jié)直腸癌分化呈負(fù)相關(guān)。TMEM206能夠增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的p-AKT水平，而AKT在腫瘤增殖、侵襲和遷移中起重要調(diào)節(jié)作用［7-8］，同時(shí)，p-ERK（p44/p42）也明顯變化，其參與Ras/Raf/MEK/ERK途徑［9］。進(jìn)入細(xì)胞核的ERK活性形式作用于各種轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞分化、增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)［10-11］，在腫瘤EMT中也起著重要作用。

圖2 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、EGF處理后結(jié)直腸癌細(xì)胞中EMT和EGFR-ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白表達(dá)的變化Fig.2 Changes in the expression of EMT and EGFR-ERK/MAPK signaling-related proteins in plasmid-transfected colorectal cancer cells after EGF treatment

圖3 通過免疫共沉淀檢測Myc-tag、E-cadherin和c-Myc之間的相互作用Fig.3 Interaction between Myc-tag，E-cadherin，and c-Myc as observed by immunoprecipitation

圖4 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、EGF處理后結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力 ×200Fig.4 Invasion and migration of plasmid-transfected colorectal cancer cells after EGF treatment ×200

本研究探討了TMEM206在結(jié)直腸癌中對EMT的作用。在EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin、Snail、Slug及其他間質(zhì)特性蛋白表達(dá)上調(diào)［12-13］，導(dǎo)致細(xì)胞極性改變、細(xì)胞骨架重建以及細(xì)胞間黏附喪失，從而使細(xì)胞獲得高遷移、高侵襲、抗凋亡等間質(zhì)表型特征。本研究首次發(fā)現(xiàn)，TMEM206過表達(dá)促進(jìn)EGF誘導(dǎo)的2種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的EMT。眾所周知，EMT（從E-cadherin減少的良性至浸潤性癌的初始轉(zhuǎn)化）和間充質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件。TMEM206過度表達(dá)促進(jìn)了結(jié)直腸癌中EGF誘導(dǎo)的EMT相關(guān)蛋白（E-cadherin、Fibronectin）的變化，進(jìn)一步表明TMEM206還在結(jié)直腸癌中EGF誘導(dǎo)的EMT中起重要作用。

本研究中，EGF在結(jié)直腸癌細(xì)胞中激活EGFRERK/MAPK-c-Myc信號(hào)通路，而TMEM206過表達(dá)促進(jìn)了EGF誘導(dǎo)的p-ERK和c-Myc蛋白增加，同時(shí)也促進(jìn)了EMT相關(guān)蛋白的改變，如E-cadherin減少，F(xiàn)ibronectin、Zeb1、Snail1、Snail2增加。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)也表明，TMEM206過表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了EGF對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的誘導(dǎo)。上述指標(biāo)均表 明，TMEM206與EGFR-ERK/MAPK-c-Myc信號(hào)通路在EGF誘導(dǎo)的EMT中發(fā)生了密切的相互作用。可以得出結(jié)論，TMEM206通過ERK/MAPK-c-Myc信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中EGF誘導(dǎo)的EMT。而EGFR-ERK/MAPK-c-Myc信號(hào)通路也具有重要的抗癌藥物，通過Smad2阻斷轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)通路的激活來抑制纖維連接蛋白原纖維形成，減少細(xì)胞遷移并最終抑制結(jié)直腸癌中EMT［14］。綜合之前的研究，TMEM206和ERK/MAPK-c-Myc信號(hào)通路協(xié)同作用促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。當(dāng)然，還需進(jìn)一步研究其中相應(yīng)的分子機(jī)制。

此外，越來越多的證據(jù)表明，各種癌細(xì)胞中Ca2+細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ca2+傳感器鈣調(diào)蛋白以Ca2+依賴性方式增強(qiáng)Myc轉(zhuǎn)錄和致癌活性［15］。所以，TMEM206與腫瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+的關(guān)系也需進(jìn)一步明確，未來的研究將進(jìn)一步探討。這些結(jié)果有望為結(jié)直腸癌的治療、預(yù)后評(píng)估和新靶向治療藥物的開發(fā)提供新的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究結(jié)果為TMEM206在結(jié)直腸癌中的潛在作用提供了重要的依據(jù)。雖然結(jié)直腸癌的預(yù)后優(yōu)于其他類型癌癥，但其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移極大地影響了一些結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。因此，研究TMEM206在鑒定新型靶向治療或良好的診斷標(biāo)志物中的作用至關(guān)重要。