李亞娟，孟繁杰，羅麗雙，于月新，郝冬梅

（1.錦州醫(yī)科大學北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，沈陽 110016；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學科，沈陽 110016）

耳聾的病因復雜，是多種因素共同作用的結果。據(jù)報道，50%～60%的先天性耳聾與遺傳因素有關［1］。在遺傳性耳聾中，以耳聾為唯一癥狀的非綜合征型耳聾約占70%，合并其他癥狀的綜合征型耳聾約占30%［2］。Usher綜合征（Usher syndrome，USH）是以先天性耳聾，視網(wǎng)膜色素變性，伴或不伴前庭功能障礙為特征的常染色體隱性遺傳疾?。?］。發(fā)病率為3.5/100 000～6.2/100 000［4］。Usher綜合征的基因型和表型具有臨床異質性，分為USH1，USH2和USH3 3種臨床類型［5］。目前與USH1明確有關的基因有5個：MYO7A（USH1B）、USH1C（USH1C）、CDH23（USH1D）、PCDH15（USH1F）和USH1G（USH1G）［6］。

本研究應用目標基因捕獲和高通量測序技術快速高效地檢測出一個先天性耳聾家系的致病基因PCDH15，發(fā)現(xiàn)2個新突變位點，確診先證者為USH1，并針對PCDH15基因突變?yōu)橄茸C者母親進行了產(chǎn)前診斷。

1 材料與方法

1.1 研究對象

先證者，男，8歲，足月出生，先天性耳聾，出生后抬頭、翻身、坐、爬及行走等運動發(fā)育遲緩，19個月學會走路，明顯落后于同齡幼兒，且平衡能力差，行走過程中經(jīng)常跌倒。經(jīng)過長期的平衡鍛煉后很少跌倒；2歲時行人工耳蝸植入獲得聽力，目前語言溝通能力良好；2.5歲發(fā)現(xiàn)視力異常，經(jīng)外院檢查為弱視和散光。先證者父母表型正常，非近親結婚，無家族遺傳病史。先證者母親再次懷孕，于孕18周進行產(chǎn)前胎兒基因診斷。本研究經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（原中國人民解放軍第202醫(yī)院）倫理委員會批準，先證者父母簽署知情同意書?；颊呒蚁祱D見圖1。

1.2 方法

1.2.1 樣本獲取和DNA提?。翰杉茸C者和父母全血2 mL，EDTA抗凝，應用CWBIO BloodGen Midi Kit試劑盒提取DNA。先證者母親于孕18周在超聲引導下經(jīng)腹取羊水10 mL，應用TIANGEN微量樣本基因組DNA提取試劑盒提取胎兒DNA。

圖1 Usher1綜合征家系圖Fig.1 Pedigree map of a family presenting congenital deafness

1.2.2 目標基因捕獲和高通量測序：制備先證者DNA文庫，采用美國IDT公司的 xGen Exome Research Panel v1.0捕獲探針對耳聾相關基因全外顯子和相鄰內含子（50 bp）區(qū)域進行捕獲和富集，使用高通量測序平臺（Illumina hiseq X10）進行測序。測序數(shù)據(jù)采用the Burrows-Wheeler Aligner（BWA）軟件與UCSC hg19人類參考序列進行比對和鑒別遺傳變異，注釋信息包括堿基和氨基酸的保守性，生物學功能預測，正常人群分布頻率數(shù)據(jù)庫（DYDF、dbSNP、千人基因組、千人南方、千人北方和EXAC），人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD、OMIM和Clinvar）。

1.2.3 引物設計和PCR擴增：針對高通量測序篩選出的PCDH15基因突變位點設計上下游測序引物（表1）。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應體系為50 μL。

1.2.4 Sanger測序驗證：針對PCDH15基因突變位點，使用美國ABI 3730XL測序儀對先證者和父母進行Sanger測序，采用DNASTAR軟件與參考序列（NM_001142771）進行序列比對分析。

1.2.5 致病性預測：從美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（ACMG）變異解讀規(guī)則、遺傳方式及臨床特征吻合度三方面分析篩選變異位點，三方面都符合的突變判定為致病基因。

1.2.6 胎兒產(chǎn)前診斷：確定致病基因突變位點及來源后，利用上述測序引物及PCR反應條件，通過Sanger測序對胎兒羊水DNA進行針對性突變檢測，確認胎兒是否攜帶PCDH15基因突變。

表1 PCDH15基因驗證位點的引物序列Tab.1 Primer sequence of PCDH15 gene verification site

2 結果

2.1 目標基因捕獲和高通量測序結果

檢測耳聾相關基因302個，測序量7 133 M，平均測序深度120.93%，覆蓋度99.95%，20×以上覆蓋度99.29%。結果顯示，先證者攜帶PCDH15基因第31號外顯子c.4115delG（p.G1372Efs*4）和第27號外顯子c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12）復合雜合突變。

2.2 Sanger測序驗證結果

先證者攜帶PCDH15基因第31號外顯子c.4115 delG（p.G1372Efs*4）和第27號外顯子c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12）復合雜合突變；先證者父親攜帶c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12）雜合性突變，母親攜帶c.4115delG（p.G1372Efs*4）雜合性突變。先證者的基因突變分別來源于父親和母親，該家系符合常染色體隱性遺傳，見圖2。

2.3 突變致病性分析結果

根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（ACMG）指南，c.3490_3491insA和c.4115delG為移碼突變，屬于功能缺失型突變，是極強的致病證據(jù)。PCDH15基因是已知的USH1致病基因，與先證者臨床表型和遺傳方式高度吻合。因此，先證者診斷為USH1，PCDH15基因的復合雜合突變?yōu)樵摷蚁迪忍煨远@的致病基因。

檢索正常人數(shù)據(jù)庫（DYDF，dbSNP、千人基因組、千人南方、千人北方和EXAC），c.4115delG未見收錄，c.3490_3491insA（rs746865307）頻率為0.000 23（EXAC）；檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD，OMIM和Clinvar）2種突變都未見報道。c.4115delG和c.3490_3491insA是PCDH15基因新的致病突變位點。

2.4 胎兒產(chǎn)前診斷結果

羊水DNA中檢測到胎兒攜帶PCDH15基因c.4115 delG（p.G1372Efs*4）和c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12）復合雜合突變，與先證者基因型相同，見圖2。

3 討論

USH1在3種臨床類型中是最嚴重的，以先天性雙側感音性神經(jīng)耳聾，持續(xù)的前庭功能障礙和青春期前色素性視網(wǎng)膜炎為特征［7］。USH1患者前庭功能障礙臨床表現(xiàn)為運動發(fā)育遲緩，患兒難以獨立坐穩(wěn)，需他人幫助，于生后9～11個月可以獨坐，往往到18個月后才會走路［8-9］。本研究中，先證者先天性耳聾，各項運動發(fā)育指標落后，尤以會走路時間晚為顯著特征，并有視力異常，其臨床表型特征高度符合USH1臨床類型。

圖2 PCDH15基因Sanger測序結果和PCDH15蛋白功能結構域Fig.2 Sanger sequencing of PCDH15 gene and the conserved domains of PCDH15

人類PCDH15基因編碼原鈣黏蛋白-15，含39個外顯子，1 955個氨基酸，包括胞外結構域（多達11個胞外鈣黏蛋白重復序列），1個跨膜結構域，以及細胞質結構域（CD1、CD2或CD3）［10-11］。原鈣黏蛋白-15屬于鈣依賴性細胞黏附分子鈣黏著蛋白超家族［12］，免疫細胞化學方法顯示其定位于內耳毛細胞纖毛束和視網(wǎng)膜光感受器上［13］。聽覺和平衡覺依賴于內耳毛細胞功能，位于毛細胞頂端的靜纖毛間的頂連接通過聲波和頭部運動傳遞機械力，將機械信號轉換為電信號，從而打開毛細胞的機械電傳導通道。頂連接是由原鈣黏蛋白-15和鈣黏蛋白-23形成的細絲，PCDH15基因突變影響其相互作用，導致隱性形式的耳聾［14］。最新研究［15］發(fā)現(xiàn)原鈣黏蛋白15具有順式同源二聚體結構，是毛細胞感知機械刺激的關鍵結構，PCDH15基因突變使其在毛細胞中的功能受到干擾。PCDH15基因錯義突變導致非綜合征性耳聾［10］，而許多更嚴重的突變（移碼、無義、剪接、大片段缺失）則引起綜合征性耳聾，表現(xiàn)為聽力和前庭功能受損等。PCDH15基因突變都是分散的，沒有突變熱點［16］。

通過NCBI在線生物信息學分析軟件識別PCDH15蛋白質結構域，先證者攜帶的PCDH15基因c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12），由于1 bp的插入導致該蛋白第1 164位甲硫氨酸（M）突變?yōu)樘於０罚∟），繼續(xù)翻譯12個氨基酸序列后出現(xiàn)終止密碼子，蛋白翻譯提前終止，形成截短蛋白，失去部分鈣黏蛋白重復序列，該蛋白1 164位后的結構域在真核生物高度保守，具有重要功能，該突變導致蛋白功能的失活具有致病性。c.4115delG（p.G1372Efs*4）由于1 bp的缺失導致該蛋白第1 372位甘氨酸（G）突變?yōu)楣劝彼幔‥），在1 375位提前終止翻譯，形成截短蛋白，丟失第1 375位后500多個氨基酸殘基，也可導致蛋白功能失活具有致病性。PCDH15基因的2個移碼突變可引起蛋白結構和功能的改變，或者截短蛋白通過無義RNA介導的mRNA衰變途徑被降解，從而使內耳毛細胞的頂連接失去功能，導致先證者耳聾的發(fā)生。

確定耳聾基因致病突變后，提取胎兒羊水DNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶c.4115delG（p.G1372Efs*4）和c.3490_3491insA（p.M1164Nfs*12）復合雜合突變，推測胎兒出生后會出現(xiàn)與先證者相同的表型，先證者母親知情選擇終止妊娠。

綜上所述，本研究檢出2個新的致病突變位點c.4115delG和c.3490_3491insA，豐富了PCDH15基因的突變譜。確診先證者為USH1，并針對PCDH15基因突變?yōu)橄茸C者母親進行了產(chǎn)前診斷，為患病家系的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了依據(jù)。