武楠，王曉曉，費(fèi)然，饒慧瑛，魏來，劉峰

（1.北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京大學(xué)肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044；2.清華大學(xué)附屬北京長庚醫(yī)院肝膽胰中心，北京 102218）

近年來，兒童非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率逐年升高，已成為全球共同關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一［1-5］。中國兒童疑似NAFLD患病率為9.03%［5］。兒童脂肪肝不僅本身是一種潛在的進(jìn)展性疾病，而且可以同時(shí)或者在成年后并發(fā)多種嚴(yán)重疾病，特別是糖尿病及心血管疾病，嚴(yán)重威脅其當(dāng)前和成年后的健康甚至生命［6-8］。因此，必須早防早治，避免脂肪肝向惡性結(jié)局進(jìn)展。NAFLD疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及其相關(guān)肝纖維化和肝硬化。但目前兒童NAFLD的發(fā)病機(jī)制仍不明確，故迄今為止沒有有效的藥物治療方案［9-12］。因此，建立合適的動(dòng)物模型對(duì)于研究兒童NAFLD的發(fā)病機(jī)制、改善診斷以及有效地預(yù)防和研究各種藥物的治療作用意義重大。

NAFLD動(dòng)物模型主要有飼料誘導(dǎo)模型（高脂飲食等）、基因修飾型模型（PTEN缺陷小鼠模型等）、復(fù)合性模型（聯(lián)合飲食和基因誘發(fā)模型等）［13-14］。飼料誘導(dǎo)的脂肪肝模型操作方法簡便，價(jià)格低廉，重復(fù)性好，死亡率低，是國內(nèi)外最常用的造模方法。但是目前以上這些營養(yǎng)模型僅在成年動(dòng)物身上重現(xiàn)（最常見的喂養(yǎng)開始時(shí)間為6～8周齡），對(duì)于幼齡小鼠的研究報(bào)道較少，因此，建立合適的動(dòng)物模型對(duì)于研究兒童NAFLD/NASH的發(fā)病機(jī)制和新藥研發(fā)意義重大。故本研究擬開發(fā)表征能夠與兒童NASH發(fā)展背景的一致的幼年動(dòng)物模型，以期為研究兒童NAFLD/NASH提供合適的動(dòng)物模型。同時(shí)，本研究擬利用二次諧波（second harmonic generation，SHG）/雙光子激發(fā)熒光（two photon excited fluorescence，TPEF）顯微成像技術(shù)自動(dòng)化評(píng)估幼鼠模型肝纖維化進(jìn)程中膠原的變化特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

3周齡、4周齡、5周齡和6周齡雄性C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，購自北京維通利華公司。蛋氨酸膽堿缺乏飼料（methionine-and choline-deficient diet，MCD）購自江蘇美迪森公司，普通飼料購自北京維通利華公司。HE染色和天狼猩紅染色試劑盒購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。本研究方案經(jīng)由北京大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（批號(hào)：2018PHC026），符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備

將3、4、5、6周齡小鼠隨機(jī)分為MCD誘導(dǎo)組和正常飲食對(duì)照組。分別在造模0周、4周、6周和8周時(shí)處死動(dòng)物（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只），留取血清及肝組織標(biāo)本。

1.3 血清生化指標(biāo)檢測

采用全自動(dòng)生化分析儀測定肝功能指標(biāo)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）。

1.4 肝組織病理學(xué)

用4%多聚甲醛固定肝組織，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，制組織切片（厚度4 μm）。常規(guī)行HE染色和天狼猩紅染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織學(xué)變化，參照NASH臨床研究網(wǎng)絡(luò)（Clinical Research Network，CRN）分期［15］，將肝組織纖維化分為4期（S0～S4）。

1.5 肝組織膠原量化分析

將組織切片脫蠟后，使用SHG/TPEF顯微成像設(shè)備（Genesis，新加坡Histoindex公司）成像后，軟件自動(dòng)提取并分析100個(gè)膠原蛋白參數(shù)（包括膠原總定量和不同分區(qū)的膠原，如匯管區(qū)、中央靜脈區(qū)和肝小葉）。以造模后不同時(shí)間點(diǎn)和不同纖維化分期為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步采用支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）算法對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0軟件繪制生存時(shí)間Kaplan-Meier曲線，比較采用log-rank檢驗(yàn)。計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同周齡小鼠MCD誘導(dǎo)后的一般狀況

正常飲食對(duì)照組不同周齡小鼠體質(zhì)量逐漸升高；而MCD誘導(dǎo)組不同周齡的小鼠體質(zhì)量逐漸下降，見圖1。隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長，正常飲食對(duì)照組不同周齡小鼠無死亡，而MCD誘導(dǎo)組小鼠死亡數(shù)量增加，各周齡小鼠8周存活率不同，其中3周齡組最低（37.5%），4、5、6周齡組分別為62.5%、87.5%和87.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖2。

2.2 不同周齡小鼠MCD建模后相關(guān)生化學(xué)指標(biāo)

與正常飲食對(duì)照組相比，隨著MCD誘導(dǎo)時(shí)間的延長，3、4、5、6周齡MCD誘導(dǎo)組的小鼠ALT和AST水平均逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖3。

2.3 不同周齡小鼠MCD誘導(dǎo)后肝組織病理學(xué)表現(xiàn)

圖2 不同周齡小鼠MCD飲食和普通飲食后的生存曲線Fig.2 The survival curve of mice of different ages after administration of MCD diet and normal diet

正常飲食對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，偶有脂肪變。不同周齡MCD誘導(dǎo)組模型小鼠在MCD飲食4周時(shí)即可見肝內(nèi)脂肪變和散在的炎癥，其中以3周齡組脂肪變和炎癥明顯，并且隨著造模時(shí)間的延長，各組肝小葉內(nèi)脂肪變和炎癥逐漸加重。同時(shí)可見肝內(nèi)膠原量逐漸增多，肝纖維化進(jìn)展，見圖4。提示3～6周齡各組小鼠在MCD誘導(dǎo)8周后均出現(xiàn)NASH的病理特征。

2.4 不同周齡小鼠MCD誘導(dǎo)后膠原參數(shù)特征

用SHG/TPEF顯微成像技術(shù)分析肝組織內(nèi)100個(gè)膠原參數(shù)，包括16個(gè)膠原總特征、28個(gè)匯管區(qū)膠原特征、28個(gè)中央靜脈區(qū)膠原特征、28個(gè)肝小葉內(nèi)的肝竇周膠原特征。對(duì)MCD誘導(dǎo)后的不同時(shí)間點(diǎn)（0、4、6、8周）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與6周齡組比較，3、4、5周齡組小鼠肝臟膠原分布存在相似性，匯管區(qū)膠原量明顯高于6周齡組，而中央靜脈區(qū)和竇周膠原量明顯低于6周齡組；各組16個(gè)膠原總特征的指標(biāo)無顯著差異，見圖5。

各組肝組織纖維化評(píng)分結(jié)果顯示，最大評(píng)分為2分，3周齡組偶有3分，同樣，隨著纖維化分期加重，3周齡、4周齡和5周齡組的膠原分布存在相似性，匯管區(qū)的膠原量明顯高于6周齡組，而中央靜脈區(qū)的膠原和竇周膠原量明顯低于6周齡組；各組16個(gè)膠原總特征的指標(biāo)無顯著差異，見圖6。

3 討論

圖3 MCD或普通飲食0～8周后不同周齡小鼠的ALT和AST水平Fig.3 The ALT and AST level of mice of different ages after administration of MCD diet and normal diet for 0 to 8 weeks

近年來，兒童NAFLD患病率顯著增高。建立合適的反映兒童NAFLD特征的動(dòng)物模型，對(duì)研究兒童NAFLD的發(fā)病機(jī)制、藥物的篩選等有重要價(jià)值。MCD飲食所誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性炎癥及纖維化等組織病理特征與人類NASH相似，是公認(rèn)的NASH模型［11］，已廣泛用于NASH發(fā)病機(jī)制的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，從離乳3周齡幼鼠到6周齡成鼠，MCD誘導(dǎo)后ALT和AST均升高，肝損傷加重，病理上均可觀察到脂肪變、炎癥和纖維化，提示小鼠NASH模型建立成功。

研究［16-19］表明，SHG/TPEF顯微成像技術(shù)可以對(duì)不同纖維化動(dòng)物模型、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及NAFLD患者的肝臟組織內(nèi)膠原成像和定量，并可以對(duì)肝纖維化的膠原特征進(jìn)行分析。本研究中進(jìn)一步比較了MCD飲食誘導(dǎo)不同周齡小鼠NASH模型的纖維化情況，發(fā)現(xiàn)3周齡、4周齡和5周齡幼鼠的MCD模型不同分期和不同時(shí)間點(diǎn)的肝纖維化變化有相似性，其匯管區(qū)的膠原量明顯高于6周齡組，而中央靜脈區(qū)的膠原和竇周膠原量明顯低于6周齡組。SCHWIMMER等［20-23］將兒童NASH分為2種模式，即1型（成人型）和2型（兒童型）。成人型NASH中，脂肪變性、小葉炎癥和竇周纖維化有關(guān)；兒童型NASH中，脂肪變性不局限于某一特定區(qū)域，而是更廣泛地分布，且炎癥和纖維化的主要部位在匯管區(qū)，兒童型通常出現(xiàn)于兒童NASH患者。本研究中對(duì)3周齡、4周齡和5周齡幼鼠的纖維化分析結(jié)果與兒童型NASH纖維化類似，以匯管區(qū)膠原改變?yōu)橹鳎?周齡小鼠的纖維化分析結(jié)果與成人NASH纖維化類似，以竇周和中央靜脈周纖維化為主。進(jìn)一步從纖維化特征方面提示3周齡、4周齡和5周齡幼鼠適合建立兒童NASH模型。然而，這些兒童和成人NASH的病理差異是否源于這2種類型發(fā)育過程中的特定機(jī)制尚不確定。

圖4 不同周齡小鼠MCD建模不同時(shí)間點(diǎn)HE和天狼猩紅染色圖像 ×200Fig.4 The HE and sirus red staining image of mice of different ages after administration of MCD diet at different weeks ×200

圖6 不同周齡小鼠MCD建模不同纖維化分期的膠原分布特征Fig.6 The collagen features of mice of different ages at different fibrosis stage after administration of MCD diet

同時(shí)，本研究中也觀察到MCD飲食的的缺點(diǎn)是小鼠體質(zhì)量下降，3周齡組幼鼠MCD飲食至8周時(shí)，存活率只有37.5%。提示如果要觀察NASH進(jìn)程及進(jìn)行機(jī)制的分析，需綜合考慮存活率和病理特征。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MCD誘導(dǎo)的3周齡、4周齡和5周齡幼鼠的病理特征與兒童型NASH類似，可為兒童NAFLD的發(fā)病機(jī)制、診療和防治提供合適的動(dòng)物模型。