張 勇

（邯鄲學(xué)院太極文化學(xué)院，河北 邯鄲 056005）

小美牛肝菌（Boletus parviflora） 是牛肝菌科（Boletaceae） 牛肝菌屬（Boletus） 真菌，是可以食用但具有一定毒性的品種（條件可食）[1]。小美牛肝菌子實體較大，子實體如果破損受傷會變藍(lán)色，輕微的擦碰都會變成青色，因此民間又稱“見手青”“風(fēng)手青”。小美牛肝菌廣泛分布在我國云南、貴州、四川等亞熱帶地區(qū)，夏秋季多生長在混交林地上，目前分散或成群生長[2]。

生物堿（alkaloids）是一種含氮堿性有機化合物的統(tǒng)稱，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，并且在自然界中的種類也非常多，大多生物堿具有苦味，并具有一定的生理活性。許多藥用植物中都含有生物堿，但也有部分生物堿具有一定的毒性[3]。

小美牛肝菌具有迷幻毒性，過量食用會中毒產(chǎn)生幻覺，毒性潛伏期長則24 h，短則1 h。小美牛肝菌的幻覺誘發(fā)物來自于一種生物堿物質(zhì)，會影響人體中樞神經(jīng)傳遞代謝，使人產(chǎn)生“小人國幻視癥”。雖然小美牛肝菌中含有的生物堿類化合物對心腦血管疾病和高血壓、高血脂等疾病有一定功效，可以改善血流量、增加心肌耐力。但對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和運動神經(jīng)系統(tǒng)也有一定影響，嚴(yán)重者也會出現(xiàn)中毒癥狀[4]。因此，有必要對小美牛肝菌中生物堿對神經(jīng)系統(tǒng)的作用進(jìn)行深入研究。

1 試驗材料

試驗主要材料小美牛肝菌干品，購自云南麗江安盛外貿(mào)有限責(zé)任公司昆明分公司（生產(chǎn)許可證編號：SC11653010343147），雜質(zhì)含量小于0.1%。將干小美牛肝菌清洗干凈、晾干后在60℃烘箱中烘干60 min，用粉碎機粉碎成粉末，過80目篩。粉碎好的小美牛肝菌粉末用80%的乙醇作為溶劑，1∶10料液比，于60℃對小美牛肝菌粉末浸提60 min，反復(fù)洗滌浸提3次后過濾，合并濾液，上離心機，轉(zhuǎn)速為2 500 r·min-1離心15 min后取上清液，即得小美牛肝菌樣品溶液。

2 大鼠急性毒性試驗

考慮到小美牛肝菌已是人們廣泛食用的品種，推測其應(yīng)該為無毒或者低毒，主要試驗內(nèi)容是大量食用后是否有毒性。

因此，結(jié)合本次試驗條件，毒理學(xué)試驗研究不采用半致死劑量的方法，而是直接以大鼠灌胃實際無毒劑量，一次性給予20只大鼠大劑量灌胃小美牛肝菌樣品溶液，樣品溶液由小美牛肝菌粉末與純凈水按1∶10比例配制。連續(xù)觀察7 d，如果大鼠不出現(xiàn)死亡，則認(rèn)為樣品為實際無毒的物質(zhì)。

大鼠急性毒性試驗結(jié)果：灌胃后第1天觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠有多動不安現(xiàn)象，個別大鼠偶有尾部痙攣蹺蹺起現(xiàn)象；灌胃第2天觀察發(fā)現(xiàn)，還有部分大鼠出現(xiàn)躁動不安的情況，已經(jīng)沒有尾部振顫現(xiàn)象；灌胃第3天及以后大鼠正常進(jìn)食進(jìn)水，再無異?，F(xiàn)象。7 d后，20只小鼠均表現(xiàn)正常無一死亡，根據(jù)急性毒性試驗劑量分級標(biāo)準(zhǔn)可知，小美牛肝菌浸提液為一種實際無毒的物質(zhì)。但急性毒性試驗前2 d大鼠表現(xiàn)有異常，因此推斷小美牛肝菌對大鼠神經(jīng)有影響，表現(xiàn)為刺激大鼠的尾部異常動作。動物試驗再結(jié)合已有臨床研究可知，小美牛肝菌含有毒性物質(zhì)，對機體組織的運動神經(jīng)系統(tǒng)有影響。

3 大鼠脊髓損傷運動功能試驗

試驗動物采用成年健康的雄性清潔級SD大鼠，體重：（240±10）g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為scxk（湘）2014-0011，按正常條件飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對試驗大鼠進(jìn)行分組，按體重隨機分成2組，每組10只。

大鼠脊髓損傷試驗?zāi)Ｐ椭谱鳎悍Q重后將大鼠固定，按0.4 mL·100-1g-1標(biāo)準(zhǔn)，由腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，約5 min后觀察大鼠倒下四肢放松為已處于麻醉狀態(tài)。置于手術(shù)臺固定，備皮處理后在脊髓T9～T10位置切開小口，水平進(jìn)行椎板切除術(shù)，使T8段脊髓完全暴露。選用10 g金屬棒從高5 cm垂直落下撞擊脊髓，制造脊髓撞擊損傷。肉眼可見大鼠脊髓硬膜下有血腫、下肢迅速顫動。建模后將大鼠肌肉組織和表皮逐一縫合，在大鼠大腿外側(cè)每日肌肉注射80萬單位青霉素0.1 mL～0.2 mL預(yù)防感染。麻醉效力過后可見大鼠下肢無法自主移動，證明試驗?zāi)Ｐ椭谱鞒晒Α?/p>

小美牛肝菌生物堿樣品制作：取制備的小美牛肝菌粉末10 g，加入95%乙醇200 mL混合均勻，用10%氫氧化銨溶液調(diào)節(jié)至pH3，放入水浴鍋中水浴2 h，水浴溫度保持在（60±2）℃，靜置24 h后過濾濃縮得小美牛肝菌生物堿樣品溶液。

大鼠試驗建模后，試驗組大鼠每日灌胃小美牛肝菌生物堿樣品溶液，劑量為20 mg·100-1g-1，連續(xù)灌胃14 d；對照組每日灌胃同等劑量的生理鹽水，所有大鼠均正常飼養(yǎng)。

觀察脊髓受損程度，進(jìn)行Basso-Beattie-Bresna han運動評分（BBB評分）[5]。2組各取5只大鼠，在術(shù)后第1天、第7天、第14天時進(jìn)行運動評分，將大鼠放入透明空水箱中，觀察大鼠的臀、膝、踝關(guān)節(jié)行走步態(tài)和軀體運動及其協(xié)調(diào)情況，觀察時間為5 min，可適當(dāng)敲擊發(fā)也聲響刺激大鼠移動，保持大鼠在水箱中不斷活動。由熟悉該評分標(biāo)準(zhǔn)的試驗人員進(jìn)行雙盲評分，評分越低表示大鼠脊髓受損程度越高，評分結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，試驗組在術(shù)后第1天、第7天、第14天，大鼠BBB評分較對照組明顯升高，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。試驗組在術(shù)后3個時間點的平均觀察得分為8.20分，而對照組在術(shù)后3個時間點的平均觀察得分以僅為6.17分，相差2.03分，顯示出2組大鼠的運動能力均值差別較大；試驗組與對照組3個時間點的觀察得分差分別為0.23分、2.80分和3.05分，顯示出隨著時間的推移，2組大鼠的運動能力評分差越來越大。

表1 各組大鼠運動觀察評分Tab.1 Motor observation scores of rats in each group

4 大鼠脊髓含水量試驗

采用干濕重法進(jìn)行大鼠脊髓組織含水量試驗[6]。2組各取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯酸進(jìn)行過量麻醉，麻醉完成后斷頭處死，切開取T8損傷段大鼠脊髓，并圍繞脊髓中心點切取1 cm脊髓組織，用電子分析天平稱重，作為脊髓濕重。然后再放入100℃烘箱烘干24 h，稱重后作為脊髓干重，取5只大鼠稱重的平均值，大鼠脊髓含水量（W，%）計算公式為：

式中：M1為脊髓濕重（g）；M2為脊髓干重（g）。

試驗結(jié)果如表2所示。

表2 大鼠脊髓含水量測定Tab.2 Determination of water content in spinal cord of rats

由表2可以看出，試驗組平均脊髓含水量為72.86%，而對照組的平均脊髓含水量為90.68%；試驗組最高脊髓含水量為93.2%，而對照組的最高脊髓含水量僅為71.3%；5只大鼠試驗組脊髓含水量均值明顯低于對照組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。脊髓含水量的數(shù)值大小與脊髓水腫程度成正相關(guān)，表明了脊髓細(xì)胞受損傷的程度。

5 討論

生物堿對神經(jīng)系統(tǒng)會有一定的影響，藥理研究表明在各種鎮(zhèn)靜劑和抗暈厥藥中都含有微量生物堿[4]，主要起鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用。

通過大鼠脊髓損傷運動功能試驗表明，小美牛肝菌生物堿能夠防止大鼠脊髓的進(jìn)一步損傷，保護(hù)脊髓神經(jīng)的正常功能。脊髓損傷為復(fù)雜的病理生理過程，僅對大鼠脊髓受到人為破壞后的原發(fā)性損傷進(jìn)行研究，采用了干濕重法進(jìn)行大鼠脊髓組織含水量試驗，試驗結(jié)果表明，小美牛肝菌生物堿具有消炎、消腫的作用，對脊髓水腫有明顯的抑制效果，可以緩解大鼠脊髓受損后所引起的炎癥反應(yīng)，保護(hù)受損神經(jīng)元細(xì)胞。

結(jié)合大鼠急性毒性試驗結(jié)果，雖然小美牛肝菌生物堿對急慢性炎癥和運動神經(jīng)系統(tǒng)損傷有一定的抑制作用，但小美牛肝菌也含有一定的毒性物質(zhì)，對機體組織的運動神經(jīng)系統(tǒng)也有一定的副作用。

小美牛肝菌中含有生物堿，少量食用可以降低體內(nèi)膽固醇含量，若過量食用也容易導(dǎo)致生物堿中毒，患者可能會出現(xiàn)口干、麻木、惡心、嘔吐、腹瀉、腹脹等癥狀，嚴(yán)重者可能會出現(xiàn)癱瘓、痙攣、發(fā)燒、昏迷危及生命。另外小美牛肝菌中的生物堿對敏性體質(zhì)容易對其產(chǎn)生過敏，導(dǎo)致人體的皮膚過敏反應(yīng)，出現(xiàn)皮膚瘙癢、紅斑、紅色斑鳩等，但這些反應(yīng)都比較輕，在停止食用后一般都會逐漸消失。因此，小美牛肝菌生物堿的有效成份和作用機理等還有待進(jìn)一步研究。