王榮琨，王 欽，羅 欣，孫達(dá)鋒，蔣建新，朱莉偉**

（1.北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)生物質(zhì)材料與能源教育部工程研究中心，北京 100083；2.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

竹蓀 （Dictyophora indusiata） 是竹蓀屬 （Dictyophora)菌類(lèi)的總稱(chēng)，是世界上名貴的大型食用菌之一，營(yíng)養(yǎng)豐富，素有“真菌皇后”之美譽(yù)，主要分布在中國(guó)、英國(guó)、法國(guó)、日本、印度、斯里蘭卡，古巴等國(guó)家以及北美洲地區(qū)[1]。竹蓀含有多種微量元素和營(yíng)養(yǎng)成分，其所含多糖是具有高活性的大分子物質(zhì)，在降血壓、血糖以及抗腫瘤、刺激免疫方面都有一定的療效[2-3]。

多糖的提取是根據(jù)各種成分在不同介質(zhì)的溶解性差異，利用多糖與提取溶劑的溶解度參數(shù)相近，相似相溶原理，對(duì)多糖類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行提取。一般多糖在植物體內(nèi)不會(huì)單獨(dú)存在，而是與蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合在一起，因此pH直接影響到多糖在溶劑中的溶解狀態(tài)[4]。

在竹蓀多糖的提取方面，目前國(guó)內(nèi)外使用的方法有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、微波提取法、酶解提取法等。Liu X等[5]通過(guò)響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM） 優(yōu)化了竹蓀子實(shí)體多糖的提取條件，得出最佳提取條件為提取時(shí)間2.1 h，料液比為1:37，提取溫度92℃。在此條件下，竹蓀子實(shí)體多糖的試驗(yàn)提取率為（15.95±0.144）%。鞏貴麗[6]采用復(fù)合酶提取法，通過(guò)響應(yīng)面法確定最佳提取工藝為復(fù)合酶濃度組合為果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶濃度分別為1.5%、2.0%和2.0%，浸提時(shí)間、浸提溫度和pH分別為105 min、52.5℃和5.25，此時(shí)所得竹蓀多糖最大得率為 (9.77±0.18)%。黃慶斌[7]采用超聲-微波聯(lián)合提取工藝，確定超聲功率520 W，微波功率150 W，料液比1:40為竹蓀多糖提取最佳工藝參數(shù)，在此條件下竹蓀多糖提取率為12.49%。近年來(lái)，膜分離技術(shù)、超高壓提取技術(shù)、超臨界萃取技術(shù)及離子交換技術(shù)等新興的分離技術(shù)也逐漸應(yīng)用于多糖提取領(lǐng)域。

抗氧化是真菌多糖的重要應(yīng)用領(lǐng)域之一。與其他外源性抗氧化劑相比，真菌多糖具有低毒、副作用小、來(lái)源廣等特點(diǎn)。然而，當(dāng)前文獻(xiàn)中甚少有關(guān)于壓力輔助提取法對(duì)竹蓀多糖提取的考察研究，更缺少該法下所得多糖的抗氧化活性的報(bào)道。本研究中測(cè)定了不同pH水浸提法、超聲波輔助提取法及壓力輔助提取法的竹蓀多糖的提取率及抗氧化活性，并對(duì)多糖進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)表征，以探究不同提取方法對(duì)多糖提取率及抗氧化性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹蓀子實(shí)體由福建古田金唐食品有限公司提供，經(jīng)55℃烘箱烘干24 h后粉碎，過(guò)40目篩，無(wú)水乙醇抽提脫色，氣干后密封備用。

試劑：D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；1，1-二苯基-2-苦基肼 （1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑公司；氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為分析純，購(gòu)自北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

L550臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；UV-6100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海比朗儀器有限公司；Bruker-ALPHA傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），Bruker公司；BILON-1000CT型多用途恒溫超聲波提取機(jī)，上海比朗公司；318C+酶標(biāo)儀，上海歐沛公司；GS-L型反應(yīng)釜，威海嘉毅化工機(jī)械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗多糖提取

不同pH水浸提方法：稱(chēng)取3份備用的竹蓀粉末各15.0 g，分別加入蒸餾水495.0 mL，其中2份蒸餾水分別用 1 mol·L-1HCl和 4 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)到pH為3和pH為9，3份浸泡液同時(shí)于95℃水浴振蕩浸提3 h。

超聲波輔助提取法：稱(chēng)取備用的竹蓀粉末15.0 g，加入蒸餾水495.0 mL，于70℃、超聲功率500 W下輔助提取30 min，再于95℃下水浴振蕩浸提1 h。

壓力輔助提取法：稱(chēng)取備用的竹蓀粉末15.0 g，加入蒸餾水495.0 mL，放入高壓反應(yīng)釜中，于120℃、轉(zhuǎn)速50 r·min-1下輔助提取1 h，再于95℃下水浴振蕩浸提1 h。

以上提取方法所得浸提液離心后取上清液，濃縮后加入4倍體積無(wú)水乙醇，4℃過(guò)夜醇沉。沉淀分別用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，離心收集沉淀物，真空冷凍干燥后得粗多糖。粗多糖提取率（P1，%）計(jì)算公式為：

式中：m1表示所得粗多糖質(zhì)量（g）；m2表示提取原料質(zhì)量（g）。

1.3.2 粗多糖的純化

將Sevage試劑[8]（氯仿:正丁醇=4:1）以1/3糖液體積的比例加入到2 mg·mL-1的粗多糖溶液中，振搖30 min，靜置分層，取上層多糖溶液，重復(fù)多次后將多糖溶液濃縮裝入透析袋（截留分子量8 000）中，自來(lái)水透析48 h，蒸餾水透析48 h，真空冷凍干燥后得純化后的多糖。

1.3.3 單糖組成分析

多糖水解：取0.015 g的絕干樣品，加入0.150 mL 72%硫酸，于30℃下進(jìn)行水解、稀釋?zhuān)瑴缇筮M(jìn)行冷卻中和、離心，上清液使用0.220 μm微濾膜過(guò)濾[9]，濾液用離子交換色譜檢測(cè)液體中的單糖含量。

色譜條件：離子交換色譜的檢測(cè)色譜柱為Hamilton RCX-30-250/4.6（250.0 mm×4.6 mm）；淋洗液：A為150 mmol·L-1氫氧化鈉；B為150 mmol·L-1氫氧化鈉和500 mmol·L-1乙酸鈉的混合溶液；流速0.700 mL·min-1；柱溫 32℃；進(jìn)樣量 20 μL；檢測(cè)方式：脈沖安培法。

單糖組成（P2，%）的計(jì)算公式為：

式中：C1為單糖的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；C2為單糖總質(zhì)量濃度（mg·mL-1）。

多糖純度（P3，%）的計(jì)算公式為：

式中：C3為戊糖總質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；C4為己糖總質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；C5為多糖樣品測(cè)試前的配置質(zhì)量濃度（mg·mL-1）。

純多糖提取率（P4，%） 的計(jì)算公式為：

式中：P1為粗多糖提取率 （%）；P3為多糖純度 （%）。

1.3.4 多糖抗氧化性測(cè)試

清除DPPH自由基能力的測(cè)定：根據(jù)Xie[10]的方法測(cè)定竹蓀粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力，并以VC作陽(yáng)性對(duì)照，每份樣品平行操作3次，DPPH自由基的清除率（P5，%）計(jì)算公式為：

式中：A0為2 mL的DPPH自由基工作液與2 mL無(wú)水乙醇混合液的吸光度；A1為2 mL樣品液與2 mL無(wú)水乙醇混合液的吸光度；A2為2 mL DPPH自由基工作液與2 mL樣品液混合液的吸光度。

清除羥基自由基能力的測(cè)定：根據(jù)許小向等[11]的方法測(cè)定竹蓀粗多糖對(duì)羥基自由基的清除能力，并以VC作陽(yáng)性對(duì)照，每份樣品平行操作3次，羥基自由基的清除率（P6，%） 計(jì)算公式為：

式中：A4為2 mL的FeSO4溶液+2 mL水楊酸-乙醇溶液+2 mL蒸餾水+2 mL H2O2溶液的混合液的吸光度；A3為2 mL FeSO4溶液+2 mL水楊酸-乙醇溶液+2 mL樣品液+2 mL H2O2溶液的混合液的吸光度；AS為2 mL的FeSO4溶液+2 mL樣品液+2 mL蒸餾水+2 mL的H2O2溶液的混合液的吸光度。

1.3.5 紫外光譜和紅外光譜分析

將純化后的竹蓀多糖配制成濃度為0.5 mg·mL-1糖溶液，以蒸餾水作為對(duì)照，在190 nm～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。

取5 mg純化多糖樣品，與500 mg的KBr混勻研磨、壓片，在400 cm-1～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法對(duì)竹蓀多糖提取率的影響

不同提取方法對(duì)竹蓀多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，水浸提法采用了3種不同的pH條件，但不同的pH條件無(wú)論對(duì)竹蓀粗多糖提取率、粗多糖純度還是純多糖提取率，影響均不顯著，相比較而言pH為9時(shí)粗多糖純度和純多糖提取率均略高于其他pH條件水提法。劉浩等[12]在蘄山藥多糖提取中也得到了類(lèi)似的結(jié)果，在所探究的水浸提工藝因素中，pH影響并不顯著?？紤]到工藝簡(jiǎn)單的需求，采用水浸提法提取竹蓀多糖時(shí)選用pH自然較好。

當(dāng)采用超聲波輔助提取法時(shí)，粗多糖提取率、粗多糖純度和純多糖提取率均顯著高于水浸提法，其中純多糖提取率最大，達(dá)到了竹蓀原料質(zhì)量的12.28%。在壓力輔助提取法中，粗多糖提取率低，但粗多糖純度為各提取工藝之最，高達(dá)81.46%，且純多糖提取率介于水浸提法和超聲波輔助提取法二者之間?？梢?jiàn)在壓力輔助條件下，多糖提取所需時(shí)間較水浸提法短，所得多糖純度高，這在多糖提取工藝中具有一定應(yīng)用價(jià)值。

超聲波輔助提取法和壓力輔助提取法均優(yōu)于水浸提法，所得竹蓀純多糖的提取率都有不同程度的提高。這是利用了超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及高溫的熱效應(yīng)原理，能快速、有效地破碎生物細(xì)胞和組織，加快多糖的溶出。比較超聲波輔助提取法與壓力輔助提取法，可以看出超聲波輔助提取法所得多糖的粗多糖和純多糖提取率均明顯高于壓力輔助提取法，但粗多糖純度略低，推測(cè)是由于超聲波的空化作用雖有利于原料中多糖的擴(kuò)散，但同時(shí)也有利于雜質(zhì)的擴(kuò)散，所以降低了粗多糖純度。而壓力條件一方面有利于提高多糖的溶解度，但同時(shí)也會(huì)造成糖苷鍵的斷裂，促使多糖水解成單糖，因此粗多糖和純多糖提取率比水浸提法和超聲波輔助提取法都偏低。

2.2 不同提取方法對(duì)竹蓀多糖抗氧化性的影響

DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種呈紫色的穩(wěn)定自由基，與具有抗氧化性的樣品接觸后，可通過(guò)DPPH自由基褪色明顯程度來(lái)檢測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除效果。不同提取方法對(duì)竹蓀多糖對(duì)DPPH自由基清除率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，VC對(duì)DPPH自由基的清除率較好，不同提取方法的竹蓀多糖對(duì)DPPH自由基的清除率均隨質(zhì)量濃度的增加而上升，但都沒(méi)有VC效果好。不同提取方法中，超聲波輔助提取的多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，在竹蓀多糖濃度為2 mg·mL-1時(shí)可達(dá)到60.69%。

不同提取方法的竹蓀多糖對(duì)羥基自由基的清除率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，不同提取方法的竹蓀多糖對(duì)羥基自由基的清除率均隨質(zhì)量濃度的增加而上升，但都沒(méi)有VC效果好。不同提取方法中，超聲波輔助提取的多糖對(duì)于羥基自由基的清除能力同樣也是最強(qiáng)的，在竹蓀粗多糖濃度為2 mg·mL-1時(shí)可以達(dá)到46.53%。

從竹蓀多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率對(duì)比可以看出，不同提取方法對(duì)竹蓀多糖抗氧化活性影響較明顯，其中超聲波輔助提取法所得多糖抗氧化性最強(qiáng)。這可能是由于超聲波使部分竹蓀多糖的主鏈和支鏈斷裂，會(huì)降低多糖的分子量，改變多糖中各種單糖比例，從而使多糖的抗氧化性發(fā)生改變[16]。

2.3 不同提取方法的竹蓀多糖中單糖組成對(duì)比

結(jié)合不同提取方法對(duì)竹蓀多糖提取率及抗氧化性的影響，從簡(jiǎn)化工藝、節(jié)約成本的角度出發(fā)，選取了pH自然水浸提法和超聲波輔助提取法的純化竹蓀多糖進(jìn)行了水解，測(cè)定比較了兩者的單糖組成，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，不同提取方法提取的竹蓀多糖均由半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖4種單糖組成，這與連賓等[13]的研究結(jié)果一致。超聲波輔助提取法所得的竹蓀純化多糖中，木糖的含量明顯少于pH自然水浸提法所得的竹蓀純化多糖。分析可能是由于木糖的不穩(wěn)定性造成的，超聲波斷開(kāi)了多糖中木糖的糖苷鍵，使得一些木糖成為單糖溶解在提取液中，醇沉?xí)r無(wú)法被沉淀出來(lái)。

2.4 紫外可見(jiàn)光譜和紅外光譜分析

自然pH水浸提法和超聲波輔助提取法的竹蓀純化多糖在260 nm～280 nm附近沒(méi)有明顯吸收峰，說(shuō)明純化后的竹蓀多糖不含核酸和蛋白質(zhì)。2種竹蓀純化多糖的紅外吸收譜見(jiàn)圖5。

由圖5可知，兩者的特征吸收峰并無(wú)明顯差異。2種多糖均在3 411 cm-1有強(qiáng)吸收峰，是羥基的伸縮振動(dòng)引起的，由于分子內(nèi)羥基間形成氫鍵使吸收峰變寬；在2 927 cm-1的吸收峰是亞甲基的C-H伸縮振動(dòng)所引起的，為多糖物質(zhì)的特征吸收峰[8]。在1 651 cm-1的吸收峰可能是羰基的非伸縮振動(dòng)所引起的；在1 373 cm-1出現(xiàn)的特征吸收峰，說(shuō)明含有羰基對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)；1 041 cm-1的強(qiáng)吸收峰推測(cè)是由吡喃環(huán)上的C-O-C環(huán)內(nèi)醚C-O的伸縮振動(dòng)和C-O-H中的O-H變角振動(dòng)引起，890 cm-1是β-吡喃糖苷鍵的吸收峰，說(shuō)明竹蓀純化多糖含有吡喃糖，并且以β-糖苷鍵為主要連接方式[14-15]。

3 結(jié)論

對(duì)比不同提取方法的竹蓀多糖提取率，并分別對(duì)pH自然水浸提法和超聲波輔助提取法所得多糖進(jìn)行單糖組成分析、DPPH自由基與羥基自由基的清除率測(cè)定、紫外光譜和紅外光譜分析。

超聲波輔助提取、壓力輔助提取和不同pH水浸提法所得的純多糖提取率依次為12.28%、7.02%和6.61%～6.81%，并且pH對(duì)水浸提效果并無(wú)顯著影響；超聲波輔助提取法和壓力輔助提取法的竹蓀純多糖提取率均高于水浸提法，且用時(shí)更短。

不同提取方法所提取的竹蓀粗多糖，對(duì)多種自由基的清除能力均具有濃度依賴(lài)性，其抗氧化活性受提取方法影響較明顯，其中超聲波輔助提取法所得多糖抗氧化性最強(qiáng)，對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除率在濃度2 mg·mL-1時(shí)分別可達(dá)46.53%和60.69%。竹蓀多糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和木糖組成。

超聲波輔助提取法和壓力輔助提取法所得竹蓀粗多糖純度和抗氧化活性均優(yōu)于傳統(tǒng)的水浸提法，推測(cè)是由于這兩種輔助條件破壞了多糖與蛋白等雜質(zhì)的鏈接鍵，并使多糖結(jié)構(gòu)中更多的活性基團(tuán)暴露出來(lái)，從而提升了粗多糖的純度和抗氧化能力。由此可見(jiàn)，壓力輔助提取法在多糖提取工藝中具有一定的應(yīng)用價(jià)值，超聲波輔助提取法的效果最優(yōu)。