楊 哲 尹武燕 馮廣革

重癥肺炎是一種中老年人常發(fā)的危重急癥，臨床癥狀為高熱、呼吸急促、肺部濕啰音等，容易又誘發(fā)低血氧癥、中毒性休克、呼吸衰竭等嚴(yán)重的并發(fā)癥，預(yù)后較差[1]。目前臨床針對(duì)重癥肺炎的治療主要以抗感染聯(lián)合支氣管肺泡灌洗(broncho alveolar lavage, BAL)為主，收集患者的肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid, BALF)并檢測(cè)其中炎癥因子等生物標(biāo)志物，可了解患者的病情狀況。微小RNA分子(micro RNA, miRNA)是不參與編碼的RNA分子(noncoding RNA, ncRNA)，對(duì)真核細(xì)胞的基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育分化和個(gè)體發(fā)育等多方面起調(diào)控作用。有研究表明，在BALF中可檢出檢出miRNA-127[2-3]。關(guān)于miRNA-127在重癥肺炎中的表達(dá)研究已有報(bào)道，且也證實(shí)miRNA-127參與其相關(guān)基因在細(xì)胞水平上抑制肺部感染和炎癥反應(yīng)，但都是基于使用BALF治療后的一次性檢測(cè)研究，而未對(duì)治療過程中進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，這無(wú)疑會(huì)使結(jié)果產(chǎn)生偏倚。故本研究態(tài)監(jiān)測(cè)重癥肺炎患者BALF中miRNA-127表達(dá)的變化情況，并結(jié)合患者的炎癥指標(biāo)，探討miRNA-127的診斷效能，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料和方法

1.一般資料 選擇2017年1月至2019年5月，我院重癥醫(yī)學(xué)科收治的重癥肺炎患者102例作為研究對(duì)象；納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲；②經(jīng)院內(nèi)高年資醫(yī)師按《中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)》[4]、《中國(guó)成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南(2018年版)》[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為重癥肺炎者；③患者均符合支氣管肺泡灌洗治療的適應(yīng)癥，且治療期間至少行3次氣管鏡肺泡灌洗治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲；②合并有囊性纖維病等嚴(yán)重肺部疾病；③合并其他嚴(yán)重感染者或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、血管炎等患者；④BALF收集操作不合格者；⑤氣管鏡肺泡灌洗≤2次者。⑥存在支氣管灌洗治療禁忌癥者；本研究已經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有檢查治療手段以及研究目的已提前告知患者和家屬，患者或家屬已簽署知情同意書。

2.治療方法和預(yù)后判斷 (1)所有患者采取綜合治療：給予營(yíng)養(yǎng)支持吸氧、控制體溫、支氣管擴(kuò)張劑、促進(jìn)氣道分泌物排出、改善肺通氣，使用敏感抗生素，改善循環(huán)功能，必要時(shí)采取機(jī)械通氣，防止水、電解質(zhì)平衡紊亂。BAL按照2017年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原學(xué)檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》[6]進(jìn)行。

(2)根據(jù)治療10 d后的臨床效果分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組，其中經(jīng)治療后10 d后臨床癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查及病原學(xué)檢查共4項(xiàng)檢查顯示痊愈、顯效或進(jìn)步的患者為預(yù)后良好組；綜合治療10 d后無(wú)效或死亡的患者為預(yù)后不良組。臨床效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：①四項(xiàng)檢查顯示恢復(fù)正常則判定為痊愈；②病情出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，但四項(xiàng)檢查至少有1項(xiàng)未完全恢復(fù)至正常則判定為顯效；③治療后病情存在好轉(zhuǎn)，但4項(xiàng)檢查均為達(dá)到顯效標(biāo)準(zhǔn)判定為進(jìn)步；④治療后癥狀緩解不明顯甚至病情加重則判定為無(wú)效[7]。

3.BALF采集和指標(biāo)測(cè)定 (1)BAL及BALF的收集 所有患者第1 d行纖維支氣管鏡檢查；在治療的第4、7 d經(jīng)纖維支氣管(南京恒騰電子科技有限公司)進(jìn)行BAL；選擇右肺中葉或左上葉舌段，注入0.9%氯化鈉液之后，使用合適的負(fù)壓(100 mmHg，1mmHg=0.133 kPa)吸取BALF，其中總回收率需≥30%[6]。

(2)RNA 的提取、 標(biāo)記與芯片雜交 采用 TRIzol法提取 BALF 中 RNA， 并進(jìn)行純化，應(yīng)用分光光度儀(美國(guó)NanoDrop?公司 型號(hào)：ND-1000)測(cè)定 BALF 中的 RNA 濃度，采用電泳法檢測(cè) BALF 中 RNA 的完整性；BALF中的RNA標(biāo)記和雜交根據(jù)德國(guó)QIAGEN公司提供的方法進(jìn)行，所有操作由專業(yè)人員嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法動(dòng)態(tài)檢測(cè)第1、4、7天的miR-127-5p 表達(dá)量，每次試驗(yàn)重復(fù)3次， 用 2-Δ Δ CT 表示。

(3)IL-6、IL-8及IL-10炎癥因子測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法(美國(guó)R&D Systems)對(duì)BALF 中IL-6、IL-8及IL-10水平進(jìn)行測(cè)定，所有操作由專業(yè)人員嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)(M)及四分位數(shù)間距(P25，P75)表示，用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)(率)表示，采用χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征曲線(ROC)分析 BALF 中 miR-127-5p 表達(dá)量對(duì)重癥肺炎的診斷價(jià)值。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩組基線資料對(duì)比 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組比較年齡等基線資料，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組具有可比性，見表1。

表1 兩組患者的基線資料對(duì)比

表2 兩組 miRNA-127-5p表達(dá)量及IL-6、IL-8及IL-10水平比較s，M(QR)]

表3 各參數(shù)的ROC曲線分析結(jié)果

2. 兩組miRNA-127-5p表達(dá)量以及IL-6、IL-8及IL-10水平 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)兩組患者BALF中的miRNA-127-5p表達(dá)量以及IL-6、IL-8及IL-10水平；治療第4天，預(yù)后良好組的miRNA-127-5p表達(dá)量顯著高于預(yù)后不良組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療第4天，預(yù)后良好組的IL-8，IL-10水平顯著低于預(yù)后不良組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療第7天，預(yù)后良好組的miRNA-127-5p表達(dá)量顯著高于預(yù)后不良組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療第7天，預(yù)后良好組的IL-8，IL-10水平顯著低于預(yù)后不良，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)治療，兩組的miRNA-127-5p表達(dá)量逐漸升高，IL-8，IL-10水平逐漸降低，見表2。

3. ROC曲線分析重癥肺炎患者預(yù)后相關(guān)性 ROC曲線分析治療4 d時(shí)miRNA-127-5p表達(dá)量、IL-8和IL-10水平的曲線面積分別為0.805，0.564，0.598。治療7 d時(shí)的miRNA-127-5p表達(dá)量、IL-8和IL-10水平的曲線面積分別為，0.825，0.624，0.667。各參數(shù)指標(biāo)特異度靈敏度(見表3)，其中治療4 d和7d時(shí)的miRNA-127-5p表達(dá)量重癥肺炎患者預(yù)后情況的相關(guān)性較好，曲線下面積分別為0.805和0.825，遠(yuǎn)高于其他指標(biāo)的曲線下面積(表3)。

圖1 各參數(shù)的ROC曲線分析結(jié)果

討 論

重癥肺部感染，一般認(rèn)為是嚴(yán)重的肺部感染伴有嚴(yán)重的中毒癥狀或出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，常分為重癥醫(yī)院獲得性肺炎(hospital-acquired pneumonia, HAP)和重癥社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)[8]?；颊叱０楹粑щy、持續(xù)性高熱等，病情發(fā)展迅速，多累及多個(gè)臟器，可導(dǎo)致多器官衰竭(multiple organ failure, MOF)，其中HAP病死率為15.5%～38.2%[5]，CAP病死率為20%～30%[4]。肺泡灌洗，全稱為纖維支氣管肺泡灌洗，是指通過纖維支氣管鏡注入0.9%氯化鈉液并進(jìn)行抽吸，清除充填于肺泡內(nèi)的物質(zhì)，并收集BALF，進(jìn)行炎癥、免疫細(xì)胞、可溶性物質(zhì)、癌癥細(xì)胞等相關(guān)檢查，探討病因和發(fā)病機(jī)制[6,9-10]。臨床醫(yī)生對(duì)重癥肺炎進(jìn)展認(rèn)識(shí)較淺，而且目前存在有各種樣的炎癥輔助診斷指標(biāo)，對(duì)重癥肺炎的診斷及進(jìn)程評(píng)估有較大的障礙，故尋找指征指標(biāo)是重癥肺炎的診療關(guān)鍵。近年來，miRNA已經(jīng)在心血管、自身免疫等多個(gè)領(lǐng)域指導(dǎo)疾病的診療，

miRNA在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用，而其主要是與信使RNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯進(jìn)程和(或)信使RNA的降解，最后抑制了蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到基因調(diào)控的最終目的[2]。miRNA可以負(fù)性調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，能夠參與調(diào)控其靶信使RNA的穩(wěn)定性以及翻譯效率，對(duì)人體的免疫調(diào)節(jié)，B、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖，包括抗體的產(chǎn)生都有影響。過去有報(bào)道[11～15]miRNA對(duì)于心肌損傷、膿毒癥與全身炎癥反應(yīng)的診斷十分關(guān)鍵。其中miRNA通過參與調(diào)節(jié)Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)以及細(xì)胞因子的應(yīng)答來介入人體先天免疫應(yīng)答與調(diào)節(jié)，這能夠在大幅度提升免疫力并且增強(qiáng)機(jī)體的抵抗能力[16]。

通過本項(xiàng)研究結(jié)果得知，治療4 d、7d后，預(yù)后不良組的miRNA-127-5p表達(dá)量為0.571±0.412，顯著低于預(yù)后良好組(P<0.05)，其中預(yù)后不良組經(jīng)治療后炎性因子IL-8和IL-10高于預(yù)后良好組，并且維持在相對(duì)較高的水平。筆者認(rèn)為預(yù)后不良主要原因是miRNA-127-5p參與了重癥肺炎中的免疫感染過程，預(yù)后不良組患者體內(nèi)的miRNA-127-5p水平?jīng)]有得到恢復(fù)，可能是miRNA-127-5p呈低表達(dá)時(shí)，無(wú)法通過Toll樣受體調(diào)控炎癥反應(yīng)，致使患者機(jī)體的IL-8、IL-10等炎性因子得不到有效的抑制，而炎癥因子的持續(xù)釋放，會(huì)使機(jī)體的免疫系統(tǒng)難以抑制重癥肺炎中“瀑布式”的炎癥反應(yīng)，使得炎性因子進(jìn)一步加重患者的肺部病情，甚至觸發(fā)MOF，最終導(dǎo)致患者預(yù)后不良甚至產(chǎn)生更為嚴(yán)重的后果。研究結(jié)果顯示miRNA-127-5p表達(dá)量在預(yù)測(cè)重癥肺炎患者預(yù)后具有不錯(cuò)的效能，為重癥肺炎的臨床診療提供了新的思路。

綜上認(rèn)為，肺泡灌洗液中miRNA-127-5p表達(dá)量有望成為一種判斷重癥肺炎患者的預(yù)后的新型生物標(biāo)志物。但是本研究屬于回顧性研究且時(shí)間跨度不大，納入樣本數(shù)較少，仍需在多中心聯(lián)合下采用更大樣本、前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究來進(jìn)一步證實(shí)。