周恒　孫洪娟　繆莉

摘要：以沿海灘涂土壤和種植土壤中的細(xì)菌為研究對(duì)象，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)灘涂土壤和種植土壤中細(xì)菌的種類和豐度進(jìn)行初步研究和比較。隸屬于疣微菌門的Subdivision3 genera incertae sedis，地桿菌屬，隸屬于酸桿菌門的Gp2、Gp4、Gp6，芽單胞菌屬，Lacibacterium，硝化螺旋菌屬，Povalibacter以及豐祐菌屬在種植土樣本中較為豐富，但在灘涂土樣本中卻比較匱乏;硫深海菌屬，脫硫單胞菌屬，Loktanella，濘桿菌屬，硫代鹽單胞菌屬在灘涂土樣本中較為豐富，但在種植土樣本中卻很少見。研究表明，灘涂土壤與種植土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。研究結(jié)果為灘涂土壤改良中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的監(jiān)測(cè)提供了一定的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：灘涂土壤;種植土壤;細(xì)菌;微生物群落多樣性;PCR;高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)： S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0271-05

收稿日期：2018-10-17

作者簡(jiǎn)介：周 恒（1995—），男，江蘇連云港人，碩士研究生，主要從事海洋微生物生物活性及天然活性物質(zhì)研究。E-mail：970069241@qq.com。

通信作者：繆 莉，博士，副教授，主要從事海洋微生物資源和海洋微生物活性及天然活性物質(zhì)研究。E-mail：miaoli@yzu.edu.cn。

我國海岸線漫長(zhǎng)，有遼闊的土壤面積，其中灘涂土壤面積約為200萬hm2。沿海地區(qū)由于氣候適宜，有充足的降水，雨熱同季，因此沿海灘涂土壤毫無疑問是一塊非常寶貴的后備土地資源[1]。在人口不斷增加、耕地日趨減少、淡水資源不足的壓力下，如何高效合理地改良利用大面積的鹽漬土壤，是我國面臨的一個(gè)迫在眉睫的問題[2]。近幾年，微生物群落結(jié)構(gòu)以及多樣性分析逐漸成為研究的熱點(diǎn)，李新等研究了不同鹽堿程度的土壤細(xì)菌多樣性以及其優(yōu)勢(shì)種群[3-4]。劉菲菲的研究表明，對(duì)目標(biāo)環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究和分析，可以為優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)群落功能和發(fā)現(xiàn)新的重要的微生物功能類群提供可靠的依據(jù)[5]。微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分析能夠較為準(zhǔn)確地掌握各個(gè)菌群之間的關(guān)系，從而指導(dǎo)微生物群落功能的定向調(diào)控[5]。本試驗(yàn)通過研究灘涂土壤和種植土壤中細(xì)菌群落的差異，討論灘涂土壤和種植土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群，探討如何把農(nóng)用率低的沿海灘涂土壤人工改良為適合種植的土壤，尋找改良灘涂土壤一些關(guān)鍵菌群，以期為提高灘涂土壤的農(nóng)業(yè)利用率，促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的種植土壤采自揚(yáng)州大學(xué)綠色種植試驗(yàn)田，選取農(nóng)田土層表面以下5～10 cm土層新鮮度較高的濕潤(rùn)土壤，不含土壤生物，不含植物根際等雜質(zhì)，較純，以避免提取土壤細(xì)菌微生物的DNA時(shí)混有大量土壤生物的DNA，影響試驗(yàn)結(jié)果。土壤pH值為7～8，中性偏堿。研究所用的灘涂土壤為上海市沿海未開墾的位于涂層表面10 cm以下的新鮮土壤，選取不同濕潤(rùn)梯度的灘涂土壤，為了便于進(jìn)行土壤細(xì)菌DNA的提取，采用較為干實(shí)的灘涂土壤，pH值為7.0～8.5，中性偏堿。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，pH值為7.0～7.2，水1 000 mL。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（切片水煮30 min，過濾取汁），葡萄糖 20 g，瓊脂15 g，pH值為7.0。高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀 0.5 g，七水硫酸鎂 0.5 g，氯化鈉 0.5 g，七水硫酸亞鐵 0.01 g，pH值為7.4～7.6。土壤DNA提取試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤微生物分離培養(yǎng)及計(jì)數(shù) 試驗(yàn)采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)對(duì)種植土壤和灘涂土壤中的微生物分別進(jìn)行培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，比較其豐度。制作固體培養(yǎng)基，將土壤樣品用無菌水稀釋至一定的濃度梯度并進(jìn)行涂布，每個(gè)濃度梯度做5個(gè)平行對(duì)照，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后，對(duì)培養(yǎng)細(xì)菌的LB平板進(jìn)行計(jì)數(shù);5～7 d 后，對(duì)培養(yǎng)真菌的PDA平板進(jìn)行計(jì)數(shù);10～14 d 后，對(duì)培養(yǎng)放線菌的高氏一號(hào)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 土壤樣品DNA的提取及驗(yàn)證 用土壤DNA提取試劑盒并按照試劑盒所述的步驟提取土壤樣品DNA。制作1%瓊脂糖凝膠，取5 μL待驗(yàn)證樣品DNA，加入1 μL 6×loading buffer，簡(jiǎn)單混勻后上樣，90 V，電泳1 h;電泳結(jié)束后，將凝膠放置于紫外凝膠成像儀下觀察是否有DNA條帶，并使用Nano Drop測(cè)土壤樣品DNA的濃度。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 以土壤樣品中細(xì)菌的DNA為模板和1對(duì)V3、V4正反向通用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCA-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）[7]，利用DNA聚合酶對(duì)模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR為50 μL反應(yīng)體系：各 0.2 μmol/L 正反向引物，1.5 U Pfu DNA聚合酶，4 μL 10×Pfu DNA聚合酶緩沖液，10 μmol/L dNTPs，100 ng樣品DNA，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，3 min;95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃，10 min;12 ℃冷卻。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠在90 V，電泳1 h，進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 高通量測(cè)序 提取出的DNA樣品由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。高通量測(cè)序的主要流程包括樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的樣本準(zhǔn)備，然后進(jìn)行文庫構(gòu)建，以便于能夠在目的DNA片段兩端都連接上想要的接頭。接下來進(jìn)行測(cè)序，得到DNA片段的堿基序列，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，與基因庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)的計(jì)數(shù)結(jié)果

用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)分別對(duì)種植土壤、灘涂土壤中的細(xì)菌、真菌、放線菌進(jìn)行分離培養(yǎng)并進(jìn)行計(jì)數(shù)。由表1可知，種植土壤和灘涂土壤中都是細(xì)菌數(shù)量最多，分別為1.6×106、4.3×105 CFU/g，放線菌次之，分別為7.3×105、2.4×104 CFU/g，真菌數(shù)量最少，分別為1.5×104、1.3×102 CFU/g。由于灘涂土壤中生存條件較為苛刻，灘涂土壤中細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量明顯小于種植土壤，尤其是真菌的數(shù)量，與種植土壤相比，少2個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.2 土壤樣品DNA提取及檢測(cè)

對(duì)土壤樣品分別進(jìn)行DNA提取，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，對(duì)提取得到的DNA質(zhì)量進(jìn)行觀察，結(jié)果（圖1）表明，灘涂土壤、種植土壤DNA跑膠樣品均只有1條明顯的亮帶，沒有其他的雜帶，且位置在 5 kb 之上。說明從樣品中提取的DNA較為完整，并無其他雜質(zhì);種植土壤DNA跑膠條帶明顯亮于灘涂土壤條帶，說明種植土壤樣品中DNA濃度遠(yuǎn)高于灘涂土壤樣品，種植土壤中細(xì)菌含量明顯大于灘涂土樣品。

使用NanoDrop測(cè)定灘涂土壤樣品、種植土壤樣品中DNA濃度，結(jié)果顯示灘涂土壤樣品DNA濃度為 4.8 ng/μL，種植土壤樣品DNA濃度為 8.9 ng/μL。由所測(cè)得的數(shù)據(jù)可知，種植土壤中的細(xì)菌含量大于灘涂土壤樣品。對(duì)提取得到的DNA樣品的D260 nm/D280 nm進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，灘涂土壤樣品和種植土壤樣品的D260 nm/D280 nm分別為1.89、1.93，均在1.8～2.0之間，說明提取的灘涂土壤樣品、種植土壤樣品中的DNA都較純，質(zhì)量很好。

2.3 測(cè)序結(jié)果分析

2.3.1 測(cè)序結(jié)果 對(duì)2個(gè)土壤樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，根據(jù)結(jié)果對(duì)序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，由表2可知，共得到原始序列50 111條，經(jīng)過處理后得到優(yōu)質(zhì)序列 48 247 條。在97%的相似水平下對(duì)序列進(jìn)行操作單元（OTU）的聚類，統(tǒng)計(jì)得到所有樣品在不同OTUs中的豐度信息，共產(chǎn)生12 930個(gè)OTU，其中相似的OUT分布數(shù)目為204，約占1.58%。

2.3.2 土壤樣品取樣深度驗(yàn)證 稀釋曲線反映了樣品的取樣深度，可以用來評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足以覆蓋所有類群。由圖2可知，2個(gè)土壤樣品的稀釋曲線未趨于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量偏小，不足以較為完整地反映土壤樣品的細(xì)菌群落，繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。

2.3.3 Alpha多樣性分析 Shannon指數(shù)可以用來表示細(xì)菌群落的多樣性程度，Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。由圖3可以看出，2個(gè)土壤樣本的曲線都趨向平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映土壤樣品中絕大多數(shù)的細(xì)菌物種信息;種植土壤樣本的Shannon曲線的最高點(diǎn)高于灘涂土壤樣本的Shannon曲線，說明種植土壤樣品中細(xì)菌多樣性大于灘涂土壤樣品，種植土壤中細(xì)菌物種較為豐富。

2.3.4 聚類分析 在屬的水平上，對(duì)土壤樣品中的細(xì)菌進(jìn)行聚類，依據(jù)聚類后的各土壤樣品中不同OTU所含序列數(shù)目做出熱圖（圖4），該圖能夠反映出在菌屬水平上各樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性。其中，圖中1列表示1個(gè)樣本，1行代表1個(gè)群落結(jié)構(gòu)。顏色塊代表相對(duì)物種豐度值，顏色越紅代表相對(duì)豐度越高，顏色越藍(lán)則相對(duì)豐度越低。

由圖4可知，種植土壤樣本中主要的菌屬有隸屬于疣微菌門的Subdivision3 genera incertae sedis，地桿菌屬（Geobacter），脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas），隸屬于酸桿菌門的Gp2、Gp4、Gp6，芽單胞菌屬（Gemmatimonas），Lacibacterium，硝化螺旋菌屬（Nitrospira），Povalibacter，豐祐菌屬（Opitutus），埃希氏菌屬（Escherichia），還有一些未知分類地位的菌屬;灘涂土壤樣品中主要的菌屬有硫深海菌屬（Thioprofundum），脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas），Loktanella，埃希氏菌屬（Escherichia），濘桿菌屬（Lutibacter），硫代鹽單胞菌屬（Thiohalomonas），隸屬于酸桿菌門的Gp10、Gp22，淡黃桿菌屬（Luteolibacter），脫硫念珠菌屬（Desulfomonile）以及一些未知分類地位的菌屬。

在種植土壤樣品中隸屬于疣微菌門的Subdivision3 genera incertae sedis，地桿菌屬（Geobacter），隸屬于酸桿菌門的Gp2、Gp4、Gp6，芽單胞菌屬（Gemmatimonas），Lacibacterium，硝化螺旋菌屬（Nitrospira），Povalibacter，豐祐菌屬（Opitutus）較為豐富，但是相對(duì)的在灘涂土壤樣品中這些菌屬卻比較匱乏。在灘涂土樣品中硫深海菌屬（Thioprofundum），脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas），Loktanella，濘桿菌屬（Lutibacter），硫代鹽單胞菌屬（Thiohalomonas）較為豐富，但是相對(duì)的，在種植土壤樣品中這些菌屬卻較為匱乏。

2.3.5 土壤細(xì)菌群落組成及豐度 從圖5中可以看出，種植土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬為地桿菌屬（Geobacter），所占比例為5.17%，其次是隸屬于疣微菌門的Subdivision3 genera incertae sedis，所占比例為5.10%，其他的優(yōu)勢(shì)菌屬為隸屬于酸桿菌門的Gp6，所占比例為2.65%;芽單胞菌屬（Gemmatimonas）所占比例為2.31%;Lacibacterium所占比例為2.23%;硝化螺旋菌屬（Nitrospira）所占比例為 1.74%;Povalibacter所占比例為1.72%;隸屬于酸桿菌門的Gp2，所占比例為1.54%;隸屬于酸桿菌門的Gp4，所占比例為1.49%;豐祐菌屬（Opitutus）所占比例為1.40%。灘涂土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬為硫深海菌屬（Thioprofundum），所占比例為8.07%，其次是脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas）所占比例為4.16%;Loktanella所占比例為 2.62%;濘桿菌屬（Lutibacter）所占比例為2.25%;硫代鹽單胞菌屬（Thiohalomonas）所占比例為2.14%;脫硫念珠菌屬（Desulfomonile）所占比例為1.79%;埃希氏菌屬（Escherichia）所占比例為1.49%;隸屬于酸桿菌門的Gp10，所占比例為 1.19%;隸屬于酸桿菌門的Gp22所占比例為1.15%;淡黃桿菌屬（Luteolibacter）所占比例為1.14%。

3 結(jié)論與討論

通過研究發(fā)現(xiàn)，種植土壤和灘涂土壤中細(xì)菌的含量最高，放線菌次之，真菌最低;灘涂土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌多樣性均小于種植土壤。本研究所選取的種植土壤樣本中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬為隸屬于疣微菌門的Subdivision3 genera incertae sedis，地桿菌屬（Geobacter）等。這與已報(bào)道的寶天曼落葉闊葉林土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落存在較大的差異，趙愛花等揭示種植土壤中變形菌屬為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬[8]。李鵬等研究發(fā)現(xiàn)，小蓬竹根際土壤芽孢桿菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[9]。譚淵等利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)黃連根際土壤細(xì)菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜酸菌屬[10]。本研究中還檢測(cè)到芽孢桿菌屬、嗜酸菌屬，但不作為優(yōu)勢(shì)菌屬。這與Roesch等采用高通量測(cè)序方法研究的結(jié)果[11-12]不一致，他們發(fā)現(xiàn)在一些土壤中，β-變形菌是豐度最高的亞門。不同種植土壤中的微生物種類及豐度差異明顯，這可能與檢測(cè)方法（傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、PGR-DGGE和高通量測(cè)序技術(shù)）、土壤的種類、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、光照、溫度、濕度、pH值等的不同有關(guān)，也許還與土壤中所種植植物的分泌代謝產(chǎn)物有一定的關(guān)系。

本研究所選取的灘涂土壤為上海市沿海未開墾的灘涂土壤。發(fā)現(xiàn)本灘涂土壤樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬為硫深海菌屬（Thioprofundum）、脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas）等。隋心等在利用高通量測(cè)序?qū)θ皆∪~章濕地土壤細(xì)菌多樣性的研究中發(fā)現(xiàn)，濕地的主要優(yōu)勢(shì)菌群為酸桿菌、變形菌，還包括一些浮霉菌、綠彎菌和硝化螺旋菌，還有一些少量的疣微菌和芽單胞菌屬[13]。本研究所分析得到的結(jié)果與之有一些相似性也有一些差異性。硝化螺旋菌、疣微菌和芽單胞菌在本次研究所選取的灘涂土壤中也被檢測(cè)到，同樣數(shù)量也比較少。但是優(yōu)勢(shì)菌屬卻有較大差異性。三江平原小葉章濕地的優(yōu)勢(shì)菌群含有酸桿菌而本研究結(jié)果中卻沒有，這可能與灘涂土壤的pH值有關(guān);造成灘涂土壤中微生物差異性的原因也可能包括灘涂土壤的含水量、含氧量[14]等。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)種植土壤、灘涂土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究，初步獲得其在門、綱、目、科、屬等不同分類水平上的優(yōu)勢(shì)類群和相對(duì)豐度。研究結(jié)果表明，細(xì)菌群落在屬水平上尚未明確分類信息的類群所占比例較大，使得物種注釋時(shí)的分辨率降低，基本上只能將細(xì)菌注釋到屬的分類水平?？赡苁潜狙芯恐贿x用了16S rDNA的 V3～V4可變區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，如果想要注釋到種水平，可嘗試多選用幾個(gè)可變區(qū)。高通量測(cè)序一般可以保證每個(gè)樣品測(cè)定幾萬個(gè)序列數(shù)，提高了測(cè)序深度和覆蓋度，但測(cè)序片段較短，約為 435 bp，在一定程度上降低了物種注釋的分辨率[15]。

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