陳思凱，谷智越，鄭 萍，戴 毅，冷金花，郎景和

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）作為一種慢性疾病，發(fā)生率約在10%左右，其主要癥狀表現(xiàn)為痛經(jīng)、不孕、盆腔包塊及慢性盆腔痛，其中不孕患者高達(dá)25%～50%，可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前對于EMs的治療尚無根治的方法，主要的治療策略是通過手術(shù)治療和藥物的長期管理以達(dá)到解決疼痛癥狀、保留生育功能的目的[2]。因此，對于生育功能的保留是EMs治療的一項(xiàng)重要目標(biāo)。EMs的發(fā)生和發(fā)展與多種免疫因子和免疫細(xì)胞的紊亂有關(guān)，而這些免疫因子和細(xì)胞的紊亂，例如白細(xì)胞介素（interleukine，IL）升高、巨噬細(xì)胞活化、前列腺素升高和氧化應(yīng)激作用都與不孕相關(guān)[3]。但并非所有的EMs患者都有不孕的癥狀，因此關(guān)于EMs的不孕機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

自人類微生物組研究發(fā)起以來，越來越多的研究旨在探討微生物與人類宿主的關(guān)系，例如腸道微生物[4]、胎盤微生物[5]、口腔微生物[6]、泌尿系統(tǒng)微生物[7]和皮膚微生物[8]等，揭示了細(xì)菌與人類機(jī)體共生的機(jī)制。細(xì)菌擴(kuò)增子16S核糖體RNA（16S-rRNA）測序技術(shù)的發(fā)展代替了傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，可識別更多的豐度小并且難以培養(yǎng)的細(xì)菌，為人類更深入地進(jìn)行微生物組學(xué)研究提供了更好的方法學(xué)。

女性陰道作為一個(gè)富含細(xì)菌群落的器官，主要是以乳酸桿菌為主導(dǎo)的細(xì)菌群落，其分泌的乳酸可維持陰道的弱酸性環(huán)境，以抵御外來細(xì)菌和病毒的侵襲[9-10]。有許多針對不孕患者的生殖道微生物研究都揭示了陰道內(nèi)細(xì)菌或者宮腔內(nèi)細(xì)菌的多樣性與不孕有關(guān)[11-12]，例如乳酸桿菌比例的增多對于生育結(jié)局有著積極的影響。但是目前大多數(shù)微生物組學(xué)的研究旨在針對總體不孕人群，而鮮有研究提及在EMs人群中不孕患者的微生物組學(xué)特點(diǎn)。本研究的目的旨在使用擴(kuò)增子16S-rRNA測序技術(shù)對EMs合并不孕人群的微生物組學(xué)進(jìn)行研究，通過生物信息學(xué)算法挖掘生物學(xué)標(biāo)識，為今后診斷EMs不孕建立細(xì)菌篩查模型。此外，對于細(xì)菌組學(xué)的鑒別也可以從細(xì)菌代謝機(jī)制方面為今后EMs發(fā)病機(jī)制的研究做出一定鋪墊。

1 對象與方法

1.1 研究對象本研究為單中心微生物組學(xué)及生物信息學(xué)研究，于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科進(jìn)行，時(shí)間從2018年4月—2019年9月。經(jīng)門診檢查評估，入組患者符合EMs診斷并符合手術(shù)治療標(biāo)準(zhǔn)，研究者對于將要進(jìn)行手術(shù)的住院患者及門診患者的陰道后穹窿微生物進(jìn)行收集，對于符合入組標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行篩選，后續(xù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。本研究共納入66例診斷為EMs的患者，其診斷結(jié)果由術(shù)后手術(shù)記錄及病理切片診斷或超聲檢查確認(rèn)，包括卵巢型EMs 55例、深部浸潤型EMs 22例及淺表腹膜型EMs 12例，3種不同類型的EMs有重疊。其中EMs合并不孕的患者17例為不孕組，EMs不伴有不孕史的患者49例為對照組。本研究通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)（倫理審查號JS-1532）。擴(kuò)增子16S-rRNA原始數(shù)據(jù)已上傳至美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）公共數(shù)據(jù)庫GenBank，數(shù)據(jù)編號MN663272-MN665377。

1.2 患者篩選納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入組患者經(jīng)手術(shù)后病理檢查及手術(shù)記錄證實(shí)為EMs患者。①年齡＞18歲且＜45歲；②取樣當(dāng)日前30 d未服用過抗生素；③2 d內(nèi)無性生活；④5 d內(nèi)無陰道沖洗或用藥等操作。排除標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)菌性陰道病（通過患者自述癥狀及門診陰道分泌物核酸檢查排除）；②全身急性炎癥期；③惡性腫瘤患者；④自身免疫性疾病患者；⑤孕期；⑥月經(jīng)期；⑦宮內(nèi)放置節(jié)育環(huán)。

1.3 取樣方法選取病房次日將要行手術(shù)的患者或門診就診患者，于患者術(shù)前陰道沖洗前取樣?；颊弑３纸厥?，用一次性塑料擴(kuò)陰器擴(kuò)張陰道，暴露宮頸，使用臨床用陰拭子，于陰道后穹窿蘸取分泌物。取出陰拭子時(shí)應(yīng)避免與陰道壁接觸污染，取出后將陰拭子置于冰盒，后于-80℃冰箱保存。

1.4 核糖體16S-RNA測序

1.4.1 DNA提取和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增 根據(jù)E.Z.N.A.soil試劑盒（OmegaBiotek,Norcross,GA,U.S.）說明書進(jìn)行總DNA提取，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；用338F和806R引物對V3V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4.2 Illumina MiSeq測序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences,Union City,CA,USA）進(jìn)行純化，Tris鹽酸洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用QuantiFluorTMST（Promega，USA）進(jìn)行檢測定量。根據(jù) Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。

1.5 數(shù)據(jù)處理根據(jù)重疊堿基將兩端序列進(jìn)行拼接，去除無法拼接的序列。根據(jù)100%的相似度對序列生成擴(kuò)增子序列變異表（amplicon sequence variants，ASV）。經(jīng)過去除冗余數(shù)據(jù)和刪除嵌合子序列，最終生成受試分類單元表（operational taxonomy unit，OTU）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的定量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，Stata 12軟件進(jìn)行計(jì)算，STAMP 2.1.3軟件制作柱狀圖。微生物組學(xué)alpha與beta多樣性采用R語言在Rstudio使用Linux平臺進(jìn)行分析，使用R語言將數(shù)據(jù)制圖可視化。LeFSe分析使用在線分析平臺www.ehbio.com。主坐標(biāo)分析（principle co-ordinate analysis，PCoA）是將不同組別間多種微生物菌落進(jìn)行豐度比較所產(chǎn)生的一種高維度矩陣算法，并將多維度的數(shù)據(jù)以最大差異平面投影到二維平面。從Bray-Curtis矩陣和Unifrac矩陣算法對2組微生物組間差異進(jìn)行比較算法，并且進(jìn)行加權(quán)計(jì)算。線性判別式計(jì)算（linear discriminative analysis，LDA）與LeFSe（LDA effect size）是用來計(jì)算不同組間的生物學(xué)標(biāo)識。學(xué)術(shù)界普遍采用LDA（log10）評分＞4為有生物學(xué)標(biāo)識的潛能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組一般資料比較2組年齡、身高和體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不孕組痛經(jīng)程度（VAS評分）低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 2組一般資料比較

2.2 2組4種alpha多樣性與beta多樣性比較2組4種alpha多樣性指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖 1。

從beta多樣性柱狀圖中可以看出，對于不孕組患者，無論是在科水平還是屬水平，乳酸桿菌的含量比對照組稍低；并且從平均豐度來看，乳酸桿菌仍是陰道后穹窿中占主導(dǎo)地位的細(xì)菌，見圖2（見封三）。不孕組與對照組間的微生物群落并未有明顯的分離，大部分為重疊面積，見圖3（見封三）。

普氏菌屬（Prevotella）、巨型球菌屬（Megasphere）和小類桿菌屬（Dialister）這3類細(xì)菌屬在不孕組的相對平均豐度較對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。對于陰道后穹窿的細(xì)菌群落的總體統(tǒng)計(jì)，選擇相對豐度大于0.01%并且可供數(shù)據(jù)庫參考識別的細(xì)菌，共有65個(gè)細(xì)菌屬，占主導(dǎo)地位的仍是乳酸桿菌屬，但不孕組的乳酸桿菌與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2和圖4。

在不孕患者和對照組患者的LeFSe分析中，變形菌門（Proteobacteria）和 γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）的 LDA（log10）＞4，見圖 5。

3 討論

3.1 EMs、免疫與細(xì)菌的交聯(lián)關(guān)系EMs導(dǎo)致不孕的機(jī)制是多方面的，包括基因、解剖、內(nèi)分泌，甚至環(huán)境因素。EMs本身為一種炎癥性疾病，巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的異?；罨騃L等細(xì)胞因子的異常都與其發(fā)生有關(guān)，并且會影響受精卵的著床或精子和卵子的結(jié)合[3]。有研究對總體不孕患者的宮腔或陰道微生物群落進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)一些有差異的細(xì)菌種類，例如脲原體（Ureaplasma）和加德納菌（Gardnerella）在不孕患者的子宮內(nèi)膜顯著增加[11]，并且在不孕患者中乳酸桿菌的含量明顯減少[12]。這與本研究的結(jié)果相似。乳酸桿菌作為一種主導(dǎo)陰道環(huán)境的細(xì)菌，其對于育齡期女性的生育功能有著十分重要的意義，但是其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究，可能是因?yàn)槿樗釛U菌產(chǎn)生的弱酸性環(huán)境和生物膜效應(yīng)可在免疫學(xué)水平維持生殖道微環(huán)境的平衡[9]，從而保證受精卵著床時(shí)的免疫環(huán)境處在一個(gè)正常水平。

3.2 16S-rRNA測序方法學(xué)的不足之處本研究將陰道后穹窿作為一個(gè)取樣位點(diǎn)，而沒有將子宮內(nèi)膜作為取樣位點(diǎn)，其原因是目前學(xué)術(shù)界對于子宮內(nèi)膜是否有細(xì)菌尚有爭議。在測序技術(shù)發(fā)展以前，以細(xì)菌培養(yǎng)作為研究微生物作為主要手段的時(shí)代，普遍接受的觀點(diǎn)是子宮內(nèi)膜應(yīng)為無菌的；但16S-rRNA測序技術(shù)發(fā)展后，許多研究都證實(shí)子宮內(nèi)膜[13]甚至胎盤[5]也存在定植菌群，并且對于一些疾病和胎兒生長都有著十分重要的關(guān)系[14]，但是這些研究并未闡明宮腔內(nèi)細(xì)菌到底是外來入侵還是正常定植[13]?！蹲匀弧冯s志最新的一項(xiàng)研究顯示，此前對于胎盤定植細(xì)菌的研究可能是由于測序方法不完善所導(dǎo)致的污染[15]，該觀點(diǎn)在學(xué)界引發(fā)了新的爭議。因此筆者認(rèn)為，內(nèi)膜是否有菌應(yīng)該分特殊情況，不能一概而論，一些生殖道的亞臨床感染可能并無癥狀，也較難以做出臨床診斷，但是這些感染可能也與EMs的發(fā)生、發(fā)展有著十分重要的關(guān)系[16-17]。此外，若能在將來以細(xì)菌組學(xué)特征作為診斷方法，后穹窿作為一個(gè)易于進(jìn)行門診篩查的位點(diǎn)，可以用來進(jìn)行快速無創(chuàng)的篩查。因此，本研究針對陰道后穹窿進(jìn)行了微生物組學(xué)研究而并未將內(nèi)膜微生物納入研究范疇。

3.3 痛經(jīng)與生殖道微生態(tài)的關(guān)系本研究對于樣本人群特點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)中，發(fā)現(xiàn)不孕患者的痛經(jīng)程度較對照組低（P＜0.05），其原因可能是本研究的樣本人群偏倚導(dǎo)致的。在納入研究的統(tǒng)計(jì)人群中大部分是通過手術(shù)確診的EMs，不孕患者手術(shù)的原因多為解決不孕的問題，而對照組患者手術(shù)的原因?yàn)镋Ms導(dǎo)致的疼痛或盆腔包塊，因此導(dǎo)致不孕患者痛經(jīng)程度較低的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)論。目前對于合并不孕的EMs患者痛經(jīng)程度尚無確切的研究，但有對于無痛經(jīng)的卵巢型EMs患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)該類患者合并其他種類盆腔EMs的比例較高且臨床分期高[18]。在微生物水平的研究中，本研究得出的結(jié)論與已有研究結(jié)論大致相符[12]，即在不孕患者中乳酸桿菌的含量有所減少。在Ⅳ型陰道群落內(nèi)，巨型球菌屬或普氏菌屬等厭氧菌也可產(chǎn)生乳酸，表現(xiàn)出與乳酸桿菌類似的生理作用；但同時(shí)巨型球菌屬可能也會通過產(chǎn)生氨基酸等物質(zhì)促進(jìn)細(xì)菌性陰道病相關(guān)細(xì)菌的生長，例如陰道加德納菌或厭氧消化鏈球菌（Peptostreptococcus anaerobius）[10]。因此，以上這些細(xì)菌含量的改變可能是由于潛在的炎癥作用導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)紊亂，從而導(dǎo)致患者不孕的發(fā)生。其具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

圖1 微生物組學(xué)群落特征4種alpha多樣性指數(shù)的分析

圖4 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的微生物種類挖掘

表2 2組細(xì)菌屬平均菌群豐度比較 （%）

綜上，本研究對于EMs合并不孕和無不孕患者的陰道細(xì)菌群落進(jìn)行了比較和生物學(xué)標(biāo)識挖掘。2組患者的細(xì)菌群落在alpha多樣性中未見顯著差異，在beta多樣性中可觀察到不孕組的乳酸桿菌含量略有減少。在對于細(xì)菌相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算方面，有3種細(xì)菌屬表現(xiàn)出了顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分別是普氏菌屬、巨型球菌屬和小類桿菌屬，它們在不孕組患者明顯升高。PCoA矩陣分析未表現(xiàn)出顯著的差異。門水平的變形菌門和綱水平的γ-變形菌綱可能是潛在的生物學(xué)標(biāo)識物。糾正生殖道炎癥相關(guān)細(xì)菌的比例以及增加乳酸桿菌的含量有可能是未來改善EMs不孕的治療方法。此外，不同的細(xì)菌種類在不同個(gè)體差異較大，造成此差異的原因也是未來的研究重點(diǎn)。通過對EMs患者是否不孕的問題進(jìn)行了微生物組學(xué)角度的分析，為今后EMs不孕的機(jī)制研究和微生物診斷學(xué)發(fā)展奠定了理論學(xué)基礎(chǔ)。

圖5 生物學(xué)標(biāo)識的挖掘計(jì)算