張芳娟 牛顏冰 申少斐

摘要：研究了牡丹種皮乙酸乙酯提取物對(duì)人源性乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7）的增殖抑制率及細(xì)胞活性的影響。制備不同濃度梯度的牡丹種皮乙酸乙酯提物作用于MCF-7細(xì)胞，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，AO/PI雙染色，MTT法和線粒體膜電位法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，增殖抑制能力和線粒體膜電位變化。研究結(jié)果表明，當(dāng)牡丹種皮乙酸乙酯提物質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制效果最佳，細(xì)胞抑制率可達(dá)89.67%，并且在藥物作用下，細(xì)胞活性和線粒體膜電位均明顯下降。牡丹種皮乙酸乙酯提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長(zhǎng)有抑制作用，能夠降低細(xì)胞活性，促使MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位降低，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：牡丹種皮;乙酸乙酯提取物;MCF-7細(xì)胞;細(xì)胞活性

中圖分類號(hào)： R284.2; R285文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）04-0192-05

收稿日期：2018-12-09

基金項(xiàng)目：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：2016YJ02）;山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：201703D211001）;國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號(hào)：CARS-21）。

作者簡(jiǎn)介：張芳娟（1994—），女，甘肅天水人，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：18306891750@163.com。

通信作者：申少斐，副教授，主要從事功能活性天然產(chǎn)物的研發(fā)和利用研究。E-mail：shenshaofei@nwafu.edu.cn。

癌癥是剝奪人類生命的重要疾病之一，全球患癌人數(shù)在不斷增加，癌癥已經(jīng)成為危害社會(huì)發(fā)展、人類生活以及健康的主要因素之一[1]。全球范圍內(nèi)，每年約有120萬的女性被乳腺癌折磨，超過50%的人死亡[2]，每年增加的乳腺癌患者數(shù)量達(dá)20多萬，其中青年得病率占同期患者的20%，并呈逐漸上升趨勢(shì)[3-4]。在我國(guó)癌癥排行榜中，肝癌、乳腺癌、肺癌居于前十。近年來，由于人們生活習(xí)性、飲食等方面的變化，我國(guó)乳腺癌的發(fā)生率增長(zhǎng)近3%，對(duì)女性健康產(chǎn)生極大影響，相關(guān)部門已將其列為重點(diǎn)防治對(duì)象。為減弱其發(fā)病率和死亡率應(yīng)適時(shí)做一些早期檢查，同時(shí)加強(qiáng)女性對(duì)乳腺癌疾病的認(rèn)識(shí)[5]。

牡丹（Paeonia suffruticosa）是我國(guó)的本土花卉。2011年國(guó)家衛(wèi)生部正式將鳳丹（P.ostii T.Hong et J.X.Zhang）和紫斑牡丹（P. rockii）的籽仁油作為新資源食品應(yīng)用（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2011年第9號(hào)公告）[6]。牡丹籽油中含豐富的不飽和脂肪酸[7]，兼具保健和藥用價(jià)值。牡丹種皮作為牡丹榨油后的副產(chǎn)物，鮮少有關(guān)于其的應(yīng)用研究。劉普等于2014年對(duì)牡丹餅粕的化學(xué)成分進(jìn)行分析，首次在該品種中分離得到10個(gè)低聚茋類化合物，并通過有機(jī)波譜分析明確了這些物質(zhì)的組成[8];Gao等于2017年對(duì)牡丹種子研究分析其10種低聚茋化合物在癌細(xì)胞中的抗增殖和抗轉(zhuǎn)移的作用，并且研究發(fā)現(xiàn)的茋類化合物（Sufffruticosol A、Sufffruticosol B、Sufffruticosol C）是牡丹種子所特有的[9]。

目前，關(guān)于牡丹種皮提取物對(duì)癌細(xì)胞作用效果的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)以牡丹種皮乙酸乙酯提取物為研究對(duì)象，設(shè)置不同的藥物濃度梯度作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞，研究其對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞活性、增殖抑制作用等的影響，為牡丹種皮今后的藥用價(jià)值提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)增強(qiáng)牡丹種皮的附加價(jià)值，符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的新方向。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

牡丹種子為山西汾河牡丹實(shí)業(yè)股份有限公司提供油用牡丹鳳丹種子;MCF-7人源性乳腺癌細(xì)胞株為中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

DMEM培養(yǎng)基，F(xiàn)BS胎牛血清，美國(guó)GIBCO實(shí)驗(yàn)室;胰蛋白酶，美國(guó)Sigma公司;雙抗，北京全式金生物技術(shù)有限公司;吖啶橙（acridine orange，簡(jiǎn)稱AO）、碘化丙啶（propidium iodide，簡(jiǎn)稱PI）、Hoechst33342染液、JC-1 染色劑，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;MTT、PBS緩沖液，北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純等級(jí)。試驗(yàn)所涉及細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的溶液均已無菌處理。

1.2?主要儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司;超凈工作臺(tái)，美國(guó)Thermo公司;移液槍，德國(guó)Eppenddorf公司;SZX16型顯微鏡，日本Olympus公司;CKX41型倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司;TC20自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器，美國(guó)Thermo公司;KDC-40型離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?牡丹種皮乙酸乙酯提取物的制備

稱取適量牡丹籽粕粉末，加入60%乙醇，利用閃式提取器進(jìn)行提取。將提取液離心處理后取上清，在溫度為70 ℃ 條件下減壓蒸發(fā)去除乙醇，將乙醇提取物與超純水混合，超聲完全溶解，獲得水懸液，之后放置于分液漏斗中;加適量乙酸乙酯，振蕩混勻，靜置分層，上層為乙酸乙酯層，經(jīng)一系列處理后冷凍干燥得到乙酸乙酯提取物（ZT），稱質(zhì)量。

1.3.2?細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，依照Song等的方法[10]在溫度為37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

1.3.3?四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞致死率

MTT法能夠?qū)?xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)[11]。MTT可使細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶還原成較難溶的藍(lán)色結(jié)晶，之后通過二甲基亞砜（DMSO）將其溶解，在490 nm下測(cè)量吸光度（D）。本試驗(yàn)通過MTT法檢測(cè)藥物作用下MCF-7細(xì)胞的致死率。

（1）取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化處理后，DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL。（2）放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞貼壁。（3）貼壁后棄去原有培養(yǎng)液，分別加入90 μL不同質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）牡丹種皮乙酸乙酯提取物，3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，調(diào)零孔（僅含有DMEM培養(yǎng)基），放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（4）藥物處理24、36、48、72 h 后，各組每孔加入MTT溶液10 μL，90 μL新鮮培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育4～6 h。（5）棄上清，每孔加入110 μL 甲臜（formazan）溶解液，搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解。（6）酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處進(jìn)行每孔D值的收集，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。（7）計(jì)算相關(guān)的細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞抑制率=（陰性對(duì)照組D值-試驗(yàn)組D值）/陰性對(duì)照組D值×100%。

1.3.4?細(xì)胞染色

AO能夠透過正常細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，在熒光顯微鏡下激發(fā)出的綠色熒光是AO與細(xì)胞中的DNA結(jié)合，而激發(fā)出的橘黃色或橘紅色熒光則是其與細(xì)胞中的RNA結(jié)合[12]。PI則無法透過正常細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但是能夠穿過凋亡或已經(jīng)死亡細(xì)胞破損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下激發(fā)出的紅色熒光是由于其嵌入到凋亡細(xì)胞雙鏈DNA中[13]。本試驗(yàn)利用AO/PI雙染法[14]和Hoechst 33342染色法在顯微鏡下觀察在藥物作用下MCF-7細(xì)胞的形態(tài)變化，分析正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞的分布情況。

1.3.5?線粒體膜電位檢測(cè)

癌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的高低能夠表示細(xì)胞生長(zhǎng)活性的強(qiáng)弱，正常的癌細(xì)胞中線粒體膜電位比較高，而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)早期的一個(gè)標(biāo)志事件即線粒體膜電位降低。JC-1熒光染料[15]通常用來檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位，其以單體和多聚體的狀態(tài)與細(xì)胞結(jié)合，在顯微鏡下可呈現(xiàn)出綠色或紅色熒光。正常狀態(tài)下的細(xì)胞線粒體膜電位較高，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)上，生成多聚體，表現(xiàn)出紅色熒光;相反，當(dāng)細(xì)胞線粒體膜電位降低時(shí)，JC-1則不能聚集，只能以單體形式存在，表現(xiàn)為綠色熒光[16]。

本試驗(yàn)通過染色劑JC-1對(duì)乙酸乙酯提取物作用后的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行染色，將細(xì)胞（細(xì)胞密度為1×106 CFU/mL）接種于48孔板，次日用0、1、3 mg/mL 乙酸乙酯提取物作用于細(xì)胞。48 h后沖去原有培養(yǎng)基，加入配制好的染液，于培養(yǎng)箱中避光放置20 min。用PBS洗滌2～3次，之后在顯微鏡下觀察MCF-7細(xì)胞的線粒體膜電位變化情況。

2?結(jié)果與分析

2.1?MTT法結(jié)果

不同濃度乙酸乙酯提取物作用于MCF-7細(xì)胞72 h后細(xì)胞的形態(tài)變化情況見圖1，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，雜質(zhì)少，細(xì)胞輪廓較為清晰，細(xì)胞密度大;而上藥組中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，形狀變小，出現(xiàn)死亡或凋亡細(xì)胞以及細(xì)胞殘?jiān)蛷U棄物。說明乙酸乙酯提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞有明顯的抑制作用，并且其對(duì)細(xì)胞的抑制效果隨著藥物濃度的增大而增大。

表1顯示，隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增大，細(xì)胞抑制率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)藥物作用72 h后，ZT質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制效率最佳，細(xì)胞抑制率為89.67%，說明牡丹種皮乙酸乙酯提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞有明顯的抑制作用，并且抑制效果呈現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性和劑量依賴性。

從圖2可以看出，乙酸乙酯提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制效果，藥物質(zhì)量濃度相同時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;藥物作用時(shí)間一定時(shí)，藥物質(zhì)量濃度越大，對(duì)細(xì)胞的抑制效果越佳。

2.2?Hoechst 33342染色

利用Hoechst 33342染液對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行活力檢測(cè)，不同濃度乙酸乙酯提取物作用下MCF-7細(xì)胞的形態(tài)變化見圖3，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)正常，活性良好，細(xì)胞與染液結(jié)合，被染成均勻的藍(lán)色。而給藥組中的細(xì)胞在藥物作用下，形態(tài)產(chǎn)生變化，體積變小，與染液結(jié)合后，藍(lán)色熒光增強(qiáng)，并且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞死亡的數(shù)量越來越多。

2.3?AO/PI雙染

本試驗(yàn)通過牡丹乙酸乙酯提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)作用的影響來評(píng)估提取物的抗癌活性。不

同濃度乙酸乙酯提取物作用于MCF-7細(xì)胞48、72 h 后的形態(tài)變化見圖4，結(jié)果表明，對(duì)照組中激發(fā)出的綠色熒光區(qū)域較多，紅色熒光則鮮有出現(xiàn)，表明細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。與對(duì)照組比較，給藥組中綠色熒光區(qū)域較少，并且變暗，而指示凋亡小體的紅色熒光則愈發(fā)明顯，隨著給藥時(shí)間的增加，紅色熒光區(qū)域不斷擴(kuò)大，說明對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行給藥治療后，出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且隨著作用時(shí)間和藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象愈加明顯。

2.4?JC-1染色

不同濃度藥物作用48 h后MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況見圖5，可以明顯觀察到，同正常的細(xì)胞相比，給藥組中的細(xì)胞隨著藥物濃度的增加，其熒光現(xiàn)象表現(xiàn)為紅色熒光區(qū)域逐漸變少、變暗，而綠色熒光區(qū)域增多、變亮，說明細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位降低，JC-1沒有聚集于線粒體基質(zhì)內(nèi)，因而被激發(fā)出綠色熒光，這種現(xiàn)象表明牡丹種皮提取物可以造成線粒體膜電位下降，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，并且呈一定的劑量依賴性。

3?討論與結(jié)論

本試驗(yàn)以牡丹榨油后的種皮為材料，采用乙酸乙酯溶劑對(duì)其進(jìn)行提取。提取物作用于MCF-7細(xì)胞，之后通過AO/PI雙染、Hoechst 33342染色、MTT法和JC-1染色等對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、增殖抑制率、生長(zhǎng)活力等進(jìn)行分析研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯提取物作用于MCF-7細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生變化，形狀變小，呈渾濁狀態(tài)，部分細(xì)胞死亡;細(xì)胞抑制率隨著藥物質(zhì)量濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在藥物質(zhì)量濃度為5 mg/mL，作用72 h后，細(xì)胞抑制率可達(dá)89.67%;細(xì)胞活力明顯降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，牡丹種皮乙酸乙酯提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖作用有一定的抑制性，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性，并且細(xì)胞線粒體膜電位也隨著藥物作用濃度的增加呈下降趨勢(shì)，綠色熒光區(qū)域增多、變亮，而紅色熒光區(qū)域逐漸變少、變暗，表明牡丹種皮乙酸乙酯提物可促使MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位降低，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。本研究為今后牡丹種皮的回收利用提供了一定的研究基礎(chǔ)，可增強(qiáng)牡丹種皮的附加價(jià)值，符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的方向。

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