張運(yùn)峰，馬超穎，胡 芬，陳 超

（1. 唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000；2. 華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210）

細(xì)胞骨架由微管、微絲以及中間絲組成，是真核細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)組分，參與了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞器的定位和細(xì)胞分裂等許多重要的細(xì)胞生命活動(dòng)。細(xì)胞骨架的發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展歷程上具有里程碑式的意義[1]，早已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞骨架的觀察實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞生物學(xué)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開出率最高的項(xiàng)目之一[2]，可以幫助學(xué)生深刻理解細(xì)胞活動(dòng)的復(fù)雜性，還可以提高他們深入探索細(xì)胞奧秘的興趣[2]。傳統(tǒng)的本科細(xì)胞骨架教學(xué)實(shí)驗(yàn)一般是以洋蔥表皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，采用考馬斯亮藍(lán)對(duì)細(xì)胞骨架染色后用普通的光學(xué)顯微鏡觀察。由于考馬斯亮藍(lán)染料能對(duì)所有的蛋白著色，并不具有針對(duì)細(xì)胞骨架染色的特異性[3-4]，因此導(dǎo)致學(xué)生實(shí)驗(yàn)中難以分辨清楚洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中的微絲結(jié)構(gòu)。

免疫熒光試驗(yàn)是用特異性抗體與標(biāo)本中相應(yīng)抗原反應(yīng)后，再用熒光素標(biāo)記的第二抗體（抗抗體）與之結(jié)合，然后在熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該法具有特異性強(qiáng)、可操作性和重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定、受環(huán)境因素影響小等優(yōu)點(diǎn)，在科研中被廣泛應(yīng)用[5]。我們嘗試將這一技術(shù)引入到骨架細(xì)胞觀察實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，取得了較好教學(xué)效果

1 材料

1.1 細(xì)胞株

Hela 細(xì)胞，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2；1640培養(yǎng)基，含10%小牛血清及1%雙抗。

1.2 主要試劑和儀器

細(xì)胞固定液、PBS 緩沖液、TritonX-100、抗熒光淬滅封片劑，均購(gòu)自索萊寶生物技術(shù)公司；鼠抗人的單克隆抗體和FITC 標(biāo)記的羊抗鼠的熒光二抗，均購(gòu)自Sigma 公司。

細(xì)胞成像系統(tǒng)（Thermofisher，EVOS FL），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermofisher，4111）。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前一天，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Hela 細(xì)胞，經(jīng)過(guò)胰酶消化、細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)和全培養(yǎng)基稀釋，獲得1×104/ml 的細(xì)胞懸液。按照200 μL/孔的標(biāo)準(zhǔn)，接種細(xì)胞于48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。

2.2 細(xì)胞的固定、通透和封閉

（1）洗滌：取出細(xì)胞，用500 μL/孔的PBS緩沖液洗滌2 次，每次10 min。

（2）固定：200 μL/孔的多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫靜置20 min。

（3）通透：0.3%PBS-TritonX-100 200 μL/孔，室溫靜置5 min。

（4）洗滌：去掉PBS-TritonX-100 處理液，500 μL/孔PBS 緩沖液洗滌2 次，每次10 min。

（5）封閉：吸去PBS 緩沖液，加入100 μL/孔1%PBS-BSA 封閉液，37 ℃，30 min。

2.3 抗體的標(biāo)記和DAPI 染色

將封閉液去掉，滴加100 μL 一抗稀釋液，37 ℃孵育30 min，用PBS 緩沖液洗滌3 次，每次3 min；滴加100 μL FITC 標(biāo)記熒光二抗，37 ℃孵育20 min，PBS 洗滌1 次，5 min；滴加100 μL的抗熒光淬滅劑。

2.4 細(xì)胞的熒光觀察

使用屏幕式倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架。

3 影響實(shí)驗(yàn)效果的因素分析

免疫熒光技術(shù)應(yīng)用到細(xì)胞骨架觀察實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，是一種新的嘗試。經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)材料的選取、細(xì)胞融合度的選擇、細(xì)胞爬片的選擇、觀察裝置的選擇、教學(xué)組織形式的選擇等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果影響較大。

3.1 實(shí)驗(yàn)材料的選取

選取生長(zhǎng)較快、易于培養(yǎng)的細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)成功率更高。

3.2 細(xì)胞融合度的選擇

細(xì)胞的密度控制在50%～80%，能取得最佳效果，過(guò)高的融合度會(huì)形成很強(qiáng)的干擾效應(yīng)，降低熒光成像清晰度。

3.3 細(xì)胞爬片的選擇

實(shí)驗(yàn)沒有采用傳統(tǒng)的細(xì)胞爬片[6,7]，而是改進(jìn)為48 孔板接種，這不僅簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備步驟，降低實(shí)驗(yàn)過(guò)程的難度，利于學(xué)生的操作，同時(shí)也增強(qiáng)了指導(dǎo)教師對(duì)學(xué)生的操作過(guò)程掌控，保證了教學(xué)的效果。

3.4 觀察裝置的選擇

選擇屏幕式倒置顯微鏡或者帶顯微照相系統(tǒng)的熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，實(shí)時(shí)呈現(xiàn)并記錄保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖像的即時(shí)呈現(xiàn)有利于學(xué)生初步了解和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，及時(shí)保則便于多組間的結(jié)果比較，并減少熒光淬滅現(xiàn)象對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)節(jié)的影響。

3.5 教學(xué)組織形式的選擇

熒光顯微鏡數(shù)量是免疫熒光實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果的一個(gè)制約因素。采用分組實(shí)驗(yàn)的模式，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，使分組數(shù)量和小組各步驟間隔時(shí)間相適應(yīng)；再通過(guò)合理延長(zhǎng)個(gè)別步驟的時(shí)間，可以使各組按序進(jìn)行，避免不同組重疊交叉，保證教學(xué)組織有序、迅捷。

4 結(jié)果與討論

FITC 標(biāo)記的細(xì)胞骨架經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后，綠色熒光覆蓋了整個(gè)細(xì)胞，絲狀骨架結(jié)構(gòu)明顯（圖1）。在細(xì)胞的中心位置有一個(gè)熒光強(qiáng)度較弱的近圓形區(qū)域暗區(qū)，推測(cè)其為細(xì)胞核；熒光由其向四周延展，充滿整個(gè)細(xì)胞，且越靠近該區(qū)域，熒光的強(qiáng)度越強(qiáng)，骨架纖維越明顯。實(shí)驗(yàn)的熒光圖像結(jié)果與細(xì)胞骨架在細(xì)胞中實(shí)際分布高度一致，確定了本實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。當(dāng)學(xué)生熟悉這一技術(shù)的操作后，可以讓學(xué)生探索溫度、抗體結(jié)合時(shí)間、抗體濃度等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。有條件的實(shí)驗(yàn)室也可開展用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色觀察微絲、采用多色免疫熒光分別標(biāo)記不同細(xì)胞骨架，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更豐富、有趣。

圖1 Hela 細(xì)胞骨架的間接免疫熒光觀察