王成師，華香，濮娟，祝麗晶

(南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬漣水人民醫(yī)院，江蘇 漣水)

0 引言

食管癌是一種發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，是中國(guó)第四大常見惡性腫瘤，多年來一直威脅著人們的健康和生命。我國(guó)食管癌的發(fā)病率約占全球的50% ，有逐年升高趨勢(shì)，并且食管癌的預(yù)后很差，5 年生存率小于5%[1]。尋找有效的方法和手段輔以食管癌的早期識(shí)別和診斷，是改善食管癌預(yù)后、降低死亡率的重要措施。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)食管癌和健康人外周血輔助性T 細(xì)胞17(T helper cells 17，Th17)和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)，擬從腫瘤免疫的角度探尋食管癌的發(fā)病機(jī)制及治療干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)實(shí)現(xiàn)食管癌的早診早治具有深遠(yuǎn)的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2018 年1 月至2019 年12 月收治的40 例食管癌患者做為病例組，其中男性24 例，女性16 例，年齡62～80 歲，平均（67.1±5.1）歲，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)，且在采集標(biāo)本前尚未進(jìn)行手術(shù)、放化療以及免疫抑制劑等治療，所有患者均不合并高血壓、糖尿病、冠心病、結(jié)締組織病等慢性疾病以及急性感染。另選取同期于我院體檢健康者35 例作為對(duì)照組，其中男23 例，女12 例，年齡64～76 歲，平均（69.3±4.2）歲。兩組在年齡和性別分布上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 標(biāo)本采集

收集我院初次住院患者入院次日空腹靜脈血，體檢者于體檢當(dāng)日空腹采集靜脈血，分別采集肝素抗凝靜脈血2mL。

1.3 Treg、Th17 檢測(cè)

采集標(biāo)本后，按照試劑盒說明書進(jìn)行上機(jī)前處理準(zhǔn)備。

1.3.1 Th17 的檢測(cè)

取肝素鈉抗凝的全血標(biāo)本100uL，用RPMI 1640 1：1 等體積稀釋，加入2ul 白細(xì)胞激活劑后置于37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-6小時(shí)；加入20uL CD8 PerCP-Cy5.5 和5uL CD3 APC，避光放置15分鐘；加入100μL 固定破膜劑中的試劑 A，避光孵育15 分鐘；加入3mL PBS，1200 rpm 離心5 分鐘，棄除上清；加入100μL 的固定破膜劑中的試劑 B 和20ul IL-17A PE，避光孵育15 分鐘；加入3mL PBS，1200 rpm 離心5 分鐘，棄除上清；0.5mL PBS 重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 Treg 的檢測(cè)

在流式管內(nèi)分別加入特異性標(biāo)記的抗體；加入100μL 的待測(cè)樣本后混勻；室溫避光孵育15 分鐘；加入紅細(xì)胞裂解液，渦旋混勻，室溫避光15 分鐘；1200rpm 離心5min，棄去上清液；加入2mL 的PBS，渦旋混勻，1200rpm 離心5min，棄去上清液；加入0.5mL PBS混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)后用kaluza 分析軟件分析Th17、Treg 占CD4+T 淋巴細(xì)胞的比例，并計(jì)算Th17/Treg。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)某一食管癌患者的外周血中Th17 和Treg 占CD4+T 淋巴細(xì)胞比例，如圖1。

圖1 某食管癌患者外周血中Th17 和Treg 占CD4+T 淋巴細(xì)胞比例

2.2 食管癌組外周血Th17、Treg 占CD4+T 淋巴細(xì)胞比例及Th17/Treg 分別為2.45±0.88、6.68±1.59、0.36±0.10，顯著高于對(duì)照組（1.02±0.55、4.62±1.43、0.25±0.18），統(tǒng)計(jì)分析顯示P＜0.05，如表1。

表1 食管癌組與對(duì)照組外周血Th17、Treg 占CD4+T 淋巴細(xì)胞比例及Th17/Treg 比較

表1 食管癌組與對(duì)照組外周血Th17、Treg 占CD4+T 淋巴細(xì)胞比例及Th17/Treg 比較

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3 討論

食管癌是最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率世界上不同國(guó)家間差異很大，全世界每年約有30 萬人死于食管癌[2]。我國(guó)是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，發(fā)病率在各類消化系統(tǒng)腫瘤中位居第2 位，男性多于女性，發(fā)病年齡多在40 歲及以上[3,4]。食管癌典型的癥狀為進(jìn)行性吞咽困難，先是難咽干的食物，繼而是半流質(zhì)食物，最后水和唾液也難以下咽，患者確診時(shí)基本已處于中晚期，雖采用手術(shù)、放療、化療等治療措施，但死亡率仍很高[5]。食管癌的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫功能狀況密切有關(guān)。機(jī)體抗腫瘤免疫以細(xì)胞免疫為主，其中 T 淋巴細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤免疫中起調(diào)控及免疫監(jiān)視作用[6]。因此，本文從腫瘤免疫的角度探尋食管癌的發(fā)病機(jī)制。

Treg 是一類具有免疫抑制功能的細(xì)胞亞群，在腫瘤的免疫逃逸以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[7]。Th17 主要分泌白細(xì)胞介素-17（IL-17），還分泌IL-22、IL-23，參與機(jī)體的炎性反應(yīng)過程，近年來發(fā)現(xiàn)其與腫瘤有密切關(guān)系[8,9]。Treg 和Th17 均由CD4+T 細(xì)胞在不同濃度的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）作用下分化而來，二者在免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著相互拮抗的平衡作用[10,11]。

本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)食管癌組和健康對(duì)照組中Th17 和Treg 的相對(duì)量，結(jié)果提示食管癌患者外周血中Th17、Treg 占CD4+T淋巴細(xì)胞比例以及Th17/Treg 均明顯高于健康對(duì)照組。近年來的研究顯示，機(jī)體內(nèi)Th17 的增多，其可通過上調(diào)趨化因子表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的移行進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[12-14]；Treg 的增多可通過細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸以及細(xì)胞因子兩種途徑抑制T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答，減弱抗腫瘤效應(yīng)[15]。另外，Th17/Treg 失衡亦已報(bào)道與某些疾病，尤其是惡性腫瘤腫瘤密切相關(guān)[16-18]。所以，食管癌患者體內(nèi)Th17、Treg 占CD4+T 淋巴細(xì)胞比例以及Th17/Treg 較健康人明顯升高，細(xì)胞免疫紊亂可能在食管癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

如果能夠通過各種干預(yù)手段影響食管癌患者體內(nèi)Th17、Treg，可能為食管癌提供新的治療方案[19]。但目前仍存在許多問題尚待明確[20]，如：Th17、Treg 在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的詳細(xì)機(jī)制以及影響其分化的因素；Th17、Treg 數(shù)量變化是否功能也發(fā)生改變；干預(yù)時(shí)具體的目標(biāo)數(shù)量是多少，如何避免引起自身免疫性疾病的發(fā)生等。因此，我們?nèi)孕鑼?duì)這兩群細(xì)胞進(jìn)行更深入的研究。