趙璐，杜小明

胃癌是全球發(fā)病率及死亡率較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤［1］，其中有約30%的病例發(fā)生在中國，而且中國每年有約10萬人死于胃癌［2］。雖然D2根治性手術(shù)及術(shù)后輔助化療顯著提高了胃癌病人的5年生存率，但是對于局部晚期胃癌以及出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后的胃癌，當(dāng)前的內(nèi)科治療療效尚不理想。胃癌是一種異質(zhì)性惡性腫瘤，這是其在相同臨床分期病人中預(yù)后不同以及對標(biāo)準(zhǔn)治療反應(yīng)不同的主要原因，而基因組的復(fù)雜性和異質(zhì)性是決定臨床預(yù)后的腫瘤表型特征的根本原因［3］。因此，了解胃癌的分子和遺傳特征對胃癌的有效和個性化管理至關(guān)重要。文獻(xiàn)顯示腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）的自我更新及異常分化在惡性腫瘤的演變過程中扮演決定性角色，并且腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥等方面起重要作用［4-5］。腫瘤干細(xì)胞的自我更新及分化可以通過內(nèi)在通路及來自腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，例如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及性別決定區(qū)Y框蛋白2（SOX2，sex-determining region Y-box 2，SOX2）等。與大家熟知的胃癌治療靶點人表皮生長因子受體-2（HER-2）相比，VEGF與胃癌的研究近期才逐漸被報道，貝伐珠單抗和阿帕替尼聯(lián)合化療可能提升治療療效，但優(yōu)勢甚微［6-8］，而近期有研究顯示SOX2是胃癌預(yù)后獨立因子［9］。因此，對于腫瘤靶向治療，研究這些調(diào)節(jié)CSCs的細(xì)胞因子則具有重要的意義。目前在腫瘤組織中同時檢測VEGF及SOX2的表達(dá)及其與臨床病理特征及病人預(yù)后的關(guān)系研究較少，而在胃癌中兩者的研究更是沒有。本研究同時檢測VEGF及SOX2的蛋白表達(dá)水平及與臨床病理特征和胃癌病人預(yù)后的關(guān)聯(lián)，為后期研究VEGF及SOX2對胃癌病人預(yù)后起到的作用提供初步實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年3月至2017年12月皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院理科存檔的胃癌手術(shù)標(biāo)本40例。術(shù)前未接受放、化療，臨床病歷資料完整。年齡范圍為42～70歲，中位年齡58歲。男28例，女12例。根據(jù)第七版UICC/AJCC胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期24例。依據(jù)2016年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，病例分級為高分化9例，中分化12例，低分化19例。腫瘤侵犯固有肌層及以上18例，腫瘤侵犯漿膜層及以下共22例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例。40例病例均獲得隨訪資料，隨訪時間12～60個月，癌旁組織32例，取自胃癌切除或胃鏡活檢病人。

1.2 試劑 兔抗人單克隆VEGF抗體（NeoMarkers公司，工作液稀釋度1∶75），SOX2兔抗人多克隆抗體（NeoMarkers公司，工作液稀釋度1∶75），中性甲醛固定液、乙醇、二甲苯、枸櫞酸鹽、Z中性樹膠及過氧化氫均為國產(chǎn)產(chǎn)品，EnVision試劑盒購自于丹麥Dako公司，DAB顯色液均由實驗人員自行配制，購自上海睿鉑賽生物科技有限公司的Envision試劑盒（DAB+CHROMOGEN C試劑液和SUBSTRATE BUFFERB試劑液），按1∶100的稀釋度配置DAB顯色溶液。

1.3 實驗方法 免疫組織化學(xué)采用EnVision法。（1）首先標(biāo)記切片；（2）然后放入65℃烤箱，將烤好的切片依次輕放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液中；（3）然后將脫蠟后的切片按順序浸入裝有梯度乙醇溶液的液缸中；（4）采用微波修復(fù)方法，將切片放入微波爐中高火加熱15 min；（5）將修復(fù)完的切片浸入新配制的3%甲醇雙氧水溶液中；（6）切片用PBS緩沖液震洗三次，將切片放入雙氧水中，室溫下孵育10 min；（7）每張切片滴加已稀釋至最佳工作濃度的一抗各160μL，然后4℃冰箱孵育過夜；（8）次日每張切片均滴加二抗各160μL，放入37℃恒溫箱，孵育30 min；（9）每張切片的組織部位滴加DAB顯色液100μL，顯微鏡下觀察組織顯色情況，顯色完成后迅速用自來水沖洗；（10）切片放入蘇木素染液缸中復(fù)染，鹽酸乙醇浸洗，再放入乙醇中脫水，最后放入二甲苯中，取出后中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判定 VEGF主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)伴細(xì)胞核著色；SOX2主要定位于細(xì)胞核，部分伴有胞質(zhì)及胞膜著色，染色陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下［10-11］：（1）陽性細(xì)胞率：＜5%計0分，6%～25%計1分，26～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；（2）染色強度：無色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。由兩項積分相加進(jìn)行評分，兩者乘積＜2分為陰性表達(dá)（-），＞2分為陽性表達(dá)（+）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗（當(dāng)所有例數(shù)≥5時，用Pearsonχ2檢驗，若所得P≈0.05時，用Fisher精確檢驗，當(dāng)1≤例數(shù)＜5時，用連續(xù)校正χ2檢驗），兩種蛋白之間的相關(guān)性檢驗采用Spearman秩相關(guān)分析，生存分析應(yīng)用Kaplan-Meier法，用Long-rank檢驗進(jìn)行多組比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF和SOX2在胃癌組織和胃癌癌旁正常組織中的表達(dá) 如圖1所示，VEGF蛋白多定位于胃癌癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)定位于細(xì)胞膜，SOX2蛋白多數(shù)定位于胃癌癌細(xì)胞的細(xì)胞核，VEGF和SOX2在胃癌組織中的表達(dá)率分別為70.0%（28/40）和65.0%（26/40），與癌旁正常組織相比，二者表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 胃癌手術(shù)標(biāo)本40例中胃癌組織與癌旁正常組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及性別決定區(qū)Y框蛋白2（SOX2）表達(dá)比較

2.2 VEGF和SOX2的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（+）病人中，VEGF和SOX2蛋白陽性表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（-）病人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在胃癌分期Ⅲ～Ⅳ期的病人中，VEGF和SOX2蛋白陽性表達(dá)顯著高于Ⅰ～Ⅱ期病人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在T3～4及低分化病人中，VEGF蛋白陽性表達(dá)較T1-2及高分化病人顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而SOX2蛋白陽性表達(dá)則差異無統(tǒng)計學(xué)意義；胃癌組織中，VEGF和SOX2的陽性表達(dá)與病人的年齡性別未見明顯關(guān)聯(lián)（表2）。

表2 胃癌病人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及性別決定區(qū)Y框蛋白2（SOX2）表達(dá)與臨床病理系數(shù)關(guān)系

2.3 胃癌組織中VEGF和SOX2的表達(dá)的相關(guān)性在胃癌組織中，VEGF與SOX2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（rs＝0.375，P＝0.017），見表3。

2.4 VEGF和SOX2的表達(dá)與胃癌病人預(yù)后的關(guān)系 生存分析結(jié)果顯示，VEGF陽性表達(dá)組中中位OS（50%的個體存活時間）為28個月（95%CI：21～35個月），而VEGF陰性表達(dá)組中中位OS顯著高于VEGF陽性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.001）（圖2A）。SOX2陽性表達(dá)組中中位OS為28個月（95%CI：22個月～34個月），與陰性組者40個月（95%CI：23個月～57個月）相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.040）（圖2B）。VEGF、SOX2同時陽性表達(dá)組中中位OS為28個月（95%CI：22個月～34個月），與同時陰性表達(dá)者中位OS及VEGF或SOX2僅1種表達(dá)者中位OS：37個月（95%CI：21個月～53個月）相比減少明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.010）（圖2C）。

表3 胃癌組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與性別決定區(qū)Y框蛋白2（SOX2）表達(dá)的相關(guān)性

圖2 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及性別決定區(qū)Y框蛋白2（SOX2）表達(dá)與胃癌病人生存預(yù)后關(guān)系：A為VEGF表達(dá)陽性和陰性與胃癌病人預(yù)后關(guān)系，B為SOX2表達(dá)陽性和陰性與胃癌病人預(yù)后關(guān)系，C為VEGF及SOX2兩者不同表達(dá)狀態(tài)下與胃癌病人預(yù)后關(guān)系

3 討論

我國胃癌的總體5年生存率為30%～50%，其中一線治療失敗者對二線治療如果始終有反應(yīng)，則生存時間長于對二線化療無反應(yīng)者，但有接近40%的一線治療后病情進(jìn)展的病人對二線化療無反應(yīng)［10］。所以近年來對胃癌新靶點藥物的研究日漸增多，目前NCCN已推薦對于不可手術(shù)的局部晚期、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性胃/胃食管結(jié)合部腺癌病人，如HER-2過表達(dá)，曲妥珠單抗聯(lián)合化療可作為一線治療［11］。其他如EGF/EGFR、VEGF/VEGFR、ALK、MET和m-TOR等分子和信號通路被研究的最多。而其中VEGF不僅在腫瘤血管生成過程中起最關(guān)鍵的作用，而且還可以刺激包括造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種干細(xì)胞自我更新［12］。新的研究顯示在膠質(zhì)瘤及皮膚癌中，VEGF可以維持CSCs的干細(xì)胞狀態(tài)［13］。SOX2基因位于3q26.33，編碼317氨基酸轉(zhuǎn)錄因子，包含HMG域，可以調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的自我更新及分化，及維持體細(xì)胞向多潛能干細(xì)胞方向分化［14］，研究顯示SOX2在乳腺癌、胃癌、肺癌及卵巢癌中的CSCs中高表達(dá)，并且可以維持CSCs的干細(xì)胞狀態(tài)，提示SOX2在這些癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［15-17］。Zhao等［18］和Kim等［19］研究顯示在肺癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中，VEGF可以通過VEGFR-2/Stat3信號通路誘導(dǎo)SOX2從而抑制miR-452和驅(qū)動Slug，進(jìn)而維持腫瘤干細(xì)胞的自我更新和轉(zhuǎn)移，提示VEGF和SOX2可能在肺上皮及乳腺上皮的癌變過程中起關(guān)鍵角色。且本課題組研究結(jié)果顯示VEGF及SOX2的高表達(dá)可能提示肺鱗癌病人有著較差的預(yù)后［20］。而此次為了研究VEGF和SOX2對胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移及預(yù)后的作用，本課題組觀察了VEGF及SOX2在胃癌和癌旁正常組織的表達(dá)情況，并用統(tǒng)計學(xué)方法分析VEGF和SOX2蛋白的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系以及與胃癌病人預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果表明VEGF在胃癌組織明顯高表達(dá)，VEGF的高表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、出現(xiàn)更差的分化、更易出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移及預(yù)示更晚的臨床分期，生存分析回示VEGF預(yù)示著胃癌病人有著更差的預(yù)后。本研究結(jié)果與前期發(fā)表的VEGF和胃癌的研究結(jié)果相似，Chen等［21］及Pang等［22］的研究顯示VEGF的表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)。生存分析顯示，高VEGF表達(dá)與胃癌病人預(yù)后不良有顯著相關(guān)性，且VEGF表達(dá)是胃癌病人總生存率的獨立預(yù)后參數(shù)，甚至可能為胃癌的診斷提供了新的線索。近年來對CSCs的基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展迅速，研究表明SOX2表達(dá)測定可作為胃CSCs分離鑒定的標(biāo)志物，但是SOX2表達(dá)與病理參數(shù)和病人生存的關(guān)系仍存在爭議，早年間SOX2被報道為一種腫瘤抑制因子通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1、磷酸化Rb或p27水平從而抑制細(xì)胞生長，此外，SOX2已經(jīng)被證明可以抑制遷移p21表達(dá)上調(diào)對胃癌的侵襲作用。但近年來越來越多的研究表明SOX2在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起致癌基因的作用，抑制SOX2的表達(dá)可減少胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和致瘤潛能，并破壞腫瘤干細(xì)胞樣表型［23-25］。這和我們的研究結(jié)果相似，SOX2在胃癌中的高表達(dá)，可能促進(jìn)胃癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及提示這些病人的臨床分期較晚，且SOX2的高表達(dá)預(yù)示著這些病人有著更差的預(yù)后。

迄今，關(guān)于VEGF和SOX2在腫瘤中的研究較少，文獻(xiàn)報道二者在腫瘤中聯(lián)系可能由下列兩種機制所致：（1）VEGF通過VEGF受體-2（VEGFR-2）/stat3介導(dǎo)的Myc和SOX2的上調(diào)促進(jìn)乳腺癌和肺癌干細(xì)胞（CSC）的自我更新，VEGF高表達(dá)的腫瘤最有可能通過上調(diào)VEGF逃避抗血管生成藥物，促使CSC自我更新，在治療后重新增殖。（2）VEGFA誘導(dǎo)SOX2表達(dá)可促進(jìn)EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移。在乳腺癌細(xì)胞系和原發(fā)性腫瘤培養(yǎng)中，VEGFA快速上調(diào)SOX2表達(dá)，導(dǎo)致SNAI2誘導(dǎo)、EMT、侵襲轉(zhuǎn)移增加。除了血管生成作用外，VEGFA還上調(diào)SOX2來驅(qū)動干細(xì)胞擴(kuò)增，同時miR-452缺失和Slug上調(diào)，為腫瘤干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能提供了一種新的機制［18-19］。而我們的研究結(jié)果顯示，胃癌組織中VEGF與SOX2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)果與上述報道細(xì)胞水平研究結(jié)果相一致，并且生存分析顯示VEGF和SOX2同時高表達(dá)的病人與僅一種表達(dá)或都不表達(dá)的病人相比生存時間明顯降低，而且單因素分析結(jié)果顯示VEGF與SOX2的單獨高表達(dá)提示這些胃癌預(yù)后較差。但是這一結(jié)果仍需要后期加大樣本量和減少生存分析刪失數(shù)目的研究來進(jìn)一步驗證。

綜上所述，VEGF和SOX2在胃癌的癌變進(jìn)展演變中扮演重要角色，同時可能存在著VEGF-VEGFR-2/JAK2/STAT3-SOX2這一信號軸，做為胃癌后期靶向治療研究方向。而且迄今為止，抗VEGF在腫瘤靶向治療中取得的成功有限，考慮與抗血管生成藥物導(dǎo)致腫瘤缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致VEGF和CSC均上調(diào)相關(guān)。我們希望將VEGF與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移潛能的獲得聯(lián)系起來的機制見解，最終為VEGF通路靶向研究產(chǎn)生新的策略。

（本文圖1見插圖4-4）

圖1 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及性別決定區(qū)Y框蛋白2（SOX2）在胃癌及癌旁正常組織的表達(dá)情況：A為VEGF在胃癌組織的表達(dá)情況，B為VEGF在癌旁正常組織的表達(dá)情況，C為SOX2在胃癌組織的表達(dá)情況，D為SOX2在癌旁正常組織的表達(dá)情況