韓磊，李藝，郭廣進，趙平

前期研究［1］發(fā)現(xiàn)，模擬腰椎旋轉(zhuǎn)手法能促使急性神經(jīng)根疼痛模型大鼠痛閾短期內(nèi)出現(xiàn)快升變化，以及背根節(jié)一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）表達下調(diào)，提示手法能快速改善炎性環(huán)境和異常痛敏。另有研究［2］發(fā)現(xiàn)，瞬時感受器電位離子通道香草素受體4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）可被機械力刺激激活，稱作一種“瞬時力傳感器”；那么旋轉(zhuǎn)手法實施過程中扳動加速度瞬間增快時的旋轉(zhuǎn)力就有可能影響TRPV4的表達?，F(xiàn)已證實一氧化氮（nitric oxide，NO）是TRPV4調(diào)控的下游信號分子［3］，手法促使NOS表達下調(diào)就會導致NO合成減少，因此我們推測腰椎手法有可能抑制了TRPV4/NO此通路的活化程度，從而發(fā)揮著減輕根性疼痛的作用。本研究利用建立的由腰椎間孔外口先插入鋼棒、后植入髓核誘導的大鼠神經(jīng)根疼痛模型，通過研制出的模擬臨床腰椎旋轉(zhuǎn)手法的大鼠測試儀，旨在探討旋轉(zhuǎn)手法對背根節(jié)神經(jīng)元上TRPV4/NO通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 清潔級雄性SD大鼠144只，體質(zhì)量（150±10）g，由斯貝福實驗動物科技有限公司提供（批號15183），本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學標準。采用SPSS19.0軟件產(chǎn)生隨機數(shù)字表的方法隨機分為假手術(shù)組（n＝48）、模型組（n＝48）、模型+釕紅組（n＝48）。假手術(shù)組只在相應(yīng)椎節(jié)（L5-6）左側(cè)做局部軟組織切開，未建模，作為空白對照；模型組通過手術(shù)在特定椎節(jié)（L5-6）左側(cè)建立L5神經(jīng)根疼痛模型；模型+釕紅組在建模后向L5背根節(jié)注射TRPV4抑制劑釕紅（Ruthenium Red，RR）0.1 nmol。后兩組通過抑制TRPV4與否來觀察其在神經(jīng)根性疼痛反應(yīng)中的調(diào)控作用。

1.2 儀器與試劑 脊柱關(guān)節(jié)手法模擬裝置（國家知識產(chǎn)權(quán)局發(fā)明專利，專利號：ZL201310634617.4）；纖毛機械刺激針Von Frey Hairs，VFH（美國Stoeling公司）；TRPV4一抗（英國Abcam公司）；NO檢測試劑（江蘇Beyotime公司）；TRPV4拮抗劑釕紅（美國Sigma公司）。

1.3 模型制備 參照Song等［4］的大鼠背根神經(jīng)節(jié)壓迫模型和課題組前期研究的神經(jīng)根炎癥模型［5］，建立了在L5-6椎間孔外口先插入鋼棒“致壓”、后植入髓核“致炎”的大鼠神經(jīng)根疼痛模型。

1.4 干預方式 以上三組均施行統(tǒng)一量化的模擬腰椎旋轉(zhuǎn)手法：將大鼠束縛固定在脊柱關(guān)節(jié)手法模擬裝置上，體位設(shè)為俯臥背伸10°，施行低速-慢加速旋轉(zhuǎn)運動。首先由中立位0°以起始速度（8.33°/s）向術(shù)側(cè)勻速旋轉(zhuǎn)25°，之后再以2倍速度（16.67 °/s）繼續(xù)加速旋轉(zhuǎn)至30°結(jié)束，最后再以起始速度（8.33°/s）恢復至中立位0°，從而完成腰椎旋轉(zhuǎn)手法的整個模擬過程。于造模后第1天開始干預，頻率1次/隔日，共計完成11次，治療期為3周。

1.5 檢測指標 每組各取24只大鼠于術(shù)后第9、21天時，即L5-6手法治療5次、11次時，深麻醉后開胸，經(jīng)主動脈快速灌注法，解剖取出手術(shù)同側(cè)的L5背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG），其中18只用于TRPV4檢測；6只用于NO檢測。

TRPV4通道蛋白的表達：采用蛋白質(zhì)印跡法檢測，3個L5DRG作為一個樣本，提取組織總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)定量法進行蛋白定量后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，加入TRPV4一抗孵育過夜，沖洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗1.5 h，化學發(fā)光顯色、顯影、定影處理，獲取目的條帶，并與內(nèi)參β-actin的光密度做比較。

NO代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽含量：采用Griess Reagent法檢測，按50微升/孔，在96孔板中加入用DMEM+10%緩沖液稀釋的標本，向孔中再加入配制好的GriessⅠ和GriessⅡ，于37℃孵箱中反應(yīng)10 min，待反應(yīng)液完全混勻后，于540 mm波長檢測各孔OD值，擬合亞硝酸鹽反應(yīng)曲線，計算亞硝酸鹽含量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)值用±s表示。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，組內(nèi)前后兩兩比較采用配對t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 三組間TRPV4通道蛋白表達比較 經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法條帶（內(nèi)參為β-Actin）比較，發(fā)現(xiàn)模型組TRPV4為高表達，模型+釕紅組TRPV4表達比模型組減弱，但仍強于假手術(shù)組。以術(shù)后第9天為例，見圖1。經(jīng)腰椎旋轉(zhuǎn)手法干預后，SNK檢驗顯示三組間TRPV4蛋白平均灰度值完全不相等，而且兩兩比較均差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。見表1。

2.2 三組間NO代謝產(chǎn)物 經(jīng)腰椎旋轉(zhuǎn)手法干預后，SNK-q檢驗顯示三組間亞硝酸鹽含量均值完全不相等，而且兩兩比較均差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。因此，在術(shù)后第9、21天時模型組亞硝酸鹽含量均明顯低于模型+釕紅組，但均明顯高于假手術(shù)組。見表1。

表1 不同處理組術(shù)后第9和21天瞬時感受器電位離子通道香草素受體4（TRPV4）蛋白平均灰度值和亞硝酸鹽含量比較/（nm/mL，±s）

表1 不同處理組術(shù)后第9和21天瞬時感受器電位離子通道香草素受體4（TRPV4）蛋白平均灰度值和亞硝酸鹽含量比較/（nm/mL，±s）

注：與假手術(shù)組比較，a P＜0.001；與模型組比較，b P＜0.001

分組假手術(shù)組模型組模型+釕紅組F值P值樣本TRPV4蛋白平均灰度值 亞硝酸鹽含量術(shù)后21 d 3.84±0.08 5.31±0.19a 9.45±0.27ab 6 045.89 0.000 0數(shù) 6 6 6術(shù)后9 d 1.14±0.37 3.53±0.93a 2.41±0.75ab 18.20 0.000 0術(shù)后21 d 0.60±0.13 1.59±0.48a 1.05±0.24ab 16.62 0.000 0術(shù)后9 d 6.23±0.15 9.17±0.24a 11.36±0.33ab 2 669.98 0.000 0

3 討論

3.1 TRPV4/NO通路是調(diào)控神經(jīng)根疼痛敏感狀態(tài)的重要信號轉(zhuǎn)導通路之一 研究表明，疼痛敏感狀態(tài)多是由于DRG受損細胞的興奮性增高和異位電活動引起的，而多種離子通道被認為與DRG炎性損傷后的高興奮性有關(guān)［6-8］，如電壓門控性鈉離子通道和鉀離子通道、超極化激活性陽離子通道、機械敏感性離子通道等。其中，瞬時感受器電位離子通道家族中的香草素受體TRPV家族越發(fā)獲得當前的廣泛關(guān)注。TRPV家族包括TRPV1-6，其基因和拓撲結(jié)構(gòu)都較相近。其中TRPV4是大鼠DRG上的一種多覺型感受器，可被機械刺激、低滲、低PH值、佛波醇酯等激活，同時參與介導機械性痛敏和炎癥性痛敏［9-12］。因此，當TRPV4出現(xiàn)高表達就意味著DRG神經(jīng)痛敏狀態(tài)的存在。TRPV4受體的激活可以引起DRG神經(jīng)元細胞內(nèi)大量鈣離子內(nèi)流，導致具有鈣離子依賴性的一氧化氮合成酶促進L-精氨酸合成NO。NO是參與介導傷害性疼痛信號傳遞中的重要介質(zhì)，它既能通過cGMP-PKG通路促進興奮性神經(jīng)遞質(zhì)-谷氨酸（Glu）的釋放，又能通過此通路減緩抑制性神經(jīng)遞質(zhì)-氨基丁酸（GABA）電流；同時又能增加降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的表達量［13-15］。綜上所述，DRG損傷模型大鼠傷害性疼痛信號的傳遞途徑可能是：DRG持續(xù)壓迫和炎癥刺激能夠增加TRPV4的表達和功能，導致細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流增多，增加鈣離子依賴性NOS表達，催化L-精氨酸合成NO，進一步調(diào)節(jié)下游的cGMP-PKG級聯(lián)反應(yīng)，并調(diào)節(jié)突觸聯(lián)系，促進Glu等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和CGRP等神經(jīng)肽類物質(zhì)的釋放，從而調(diào)節(jié)傷害性疼痛信號的傳遞，這就是TRPV4/NO信號通路增高DRG細胞損傷后的電興奮，參與介導炎癥性痛敏的全過程。因此，TRPV4介導其下游信號分子NO合成，繼而促進痛敏信號的傳遞；TRPV4/NO信號通路與痛敏狀態(tài)密切相關(guān)，活化TRPV4/NO信號通路對痛敏狀態(tài)有調(diào)控作用。

3.2 腰椎旋轉(zhuǎn)手法可能通過抑制TRPV4/NO信號通路而緩解根性疼痛和痛覺敏感 近年來有學者指出，腰椎旋轉(zhuǎn)手法之所以產(chǎn)生療效并一直沿用至今，其所謂“筋歸槽”“骨合縫”機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)很可能與其力學效應(yīng)觸發(fā)了自身神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)反饋調(diào)節(jié)的生物學效應(yīng)——“抗炎鎮(zhèn)痛作用”有關(guān)［16-18］。腰椎旋轉(zhuǎn)手法的治療干預呈現(xiàn)的是一種物理形式的機械力在肌骨組織應(yīng)力點上的傳達，在某種特定的椎間關(guān)節(jié)相對運動中可以通過減緩反應(yīng)性關(guān)節(jié)高張力，而對神經(jīng)根及其周圍組織的缺血狀態(tài)產(chǎn)生影響。通過微環(huán)境的血運改善，細胞缺氧狀態(tài)逐漸緩解，以及細胞膜張力發(fā)生變化，機械敏感性離子通道亦隨之呈現(xiàn)相應(yīng)變化，細胞膜上的機械張力信號向細胞內(nèi)傳導就轉(zhuǎn)換成電信號或生化信號，進而促使炎性痛敏信號的減弱。這種機械-電信號/化學信號轉(zhuǎn)換過程可能提示了：其可能是旋轉(zhuǎn)手法“生物應(yīng)力效應(yīng)”轉(zhuǎn)換為“生物抗炎效應(yīng)”的關(guān)鍵所在。

鑒于TRPV4/NO信號通路在DRG神經(jīng)痛敏中的傳遞途徑和調(diào)控作用，它可能在“力學效應(yīng)-抗炎效應(yīng)”兩者之間起著重要的“橋梁”作用。TRPV4由于自身對機械刺激敏感特性，可作為“瞬時力傳感器”對旋轉(zhuǎn)手法產(chǎn)生的牽張力學刺激產(chǎn)生反應(yīng)。本研究證實，在適度手法干預后可以使得模型組NO的生成減少；然而通過釕紅阻斷TPRV4感受力學信號的作用，旋轉(zhuǎn)手法減少NO含量的效果就會明顯降低，其抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)就被削弱。也就是說，TRPV4/NO通路被抑制與腰椎旋轉(zhuǎn)手法快速抗炎鎮(zhèn)痛效果有密切關(guān)系，腰椎旋轉(zhuǎn)手法迅速緩解DRG神經(jīng)痛敏的作用很可能與調(diào)控DRG神經(jīng)元上的TRPV4/NO通路有關(guān)。

此外，本研究模擬了一種腰椎關(guān)節(jié)松動手法，其運動力學特征是低速度、慢加速、低幅度的旋轉(zhuǎn)運動［19-20］，也就是說通過一個增力輕柔但穩(wěn)定的扭轉(zhuǎn)力作用到病變節(jié)段的關(guān)節(jié)囊及DRG，即可活化TRPV4/NO通路達到快速鎮(zhèn)痛的效果，為臨床如何適度控制手法力度、發(fā)揮手法效應(yīng)和減少副損傷提供了重要的參考依據(jù)。模擬不同力學形式的手法進行抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)的相互比較將是下一步研究的重點。