陳嘯陽，張毅峰

（蘇州市第九人民醫(yī)院，江蘇 蘇州）

0 引言

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是以肝內(nèi)脂肪變性為主要特征的一類疾病，已成為世界上影響人類健康最常見的肝臟疾病[1,2]。研究顯示，約有20-33%的西方人和15-30%的中國人受到NAFLD 的困擾[3]。如果不加以控制，肝單純的脂肪變性可進一步發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis， NASH）、肝纖維化和肝硬化，甚至肝癌[4,5]。除此之外，NAFLD 也是2 型糖尿病、動脈粥樣硬化、心血管疾病和慢性腎病的風險因素[6,7]。NAFLD 發(fā)病機制尚不明確，目前治療手段相對局限，主要包括生活習慣干預(yù)（節(jié)食和運動）、胰島素增敏劑（吡格列酮）和他汀類降脂藥等[8]，但由于患者對生活干預(yù)的順應(yīng)性差及藥物的不良反應(yīng)，嚴重限制了NAFLD 的臨床治療效果[4]。因此，尋找有效治療NAFLD 的藥物迫在眉睫。

番茄紅素（Lycopene， Lyc）屬于類胡蘿卜素家族，是一種無環(huán)、親脂性的類胡蘿卜素，廣泛分布在紅顏色的蔬菜和水果中，如番茄、西瓜、胡蘿卜和紅葡萄柚[9,10]。研究顯示，番茄紅素具有強大的抗氧化和抗炎作用，可調(diào)節(jié)機體代謝活動，改善肥胖并發(fā)癥和修復(fù)肝功能[11]。大量動物研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可改善高脂飲食（high-fat diet， HFD）誘導的肝脂肪變性[9,12-14]。除此之外，Li 等[15]發(fā)現(xiàn)，番茄粉可通過激活Sirt1 抑制HFD 誘導的小鼠肝脂肪變性。番茄紅素作為番茄粉的主要成分，其是否可通過激活Sirt1改善NAFLD，目前尚未有研究報道。本實驗使用PA 誘導的體外NAFLD 模型，旨在探討不同劑量番茄紅素的降脂活性及其潛在機制，為臨床使用番茄紅素治療NAFLD 提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Oil Red O 粉末和棕櫚酸鈉粉末購自Sigma 公司；番茄紅素購自美國MCE 公司；TG 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Sirt1 和PPARα 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；GAPDH 抗體購自武漢proteintech 公司；ECL 購自美國Pierce 公司。

1.2 細胞株及細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞（HepG2）購自北京協(xié)和細胞庫，細胞培養(yǎng)于含10% FBS 和1%（青霉素/鏈霉素）的DMEM 完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2 的飽和濕度培養(yǎng)箱，每兩天換液一次，待細胞融合至60-80%時傳代。

1.3 MTT 實驗

將處于對數(shù)生長期的HepG2 以1×105個/mL 接種于96 孔板中，待細胞生長至60%～80% 時，使用不同濃度的番茄紅素單獨處理或與PA 共同處理24h，正常組給予空白培養(yǎng)基，處理結(jié)束后，每孔加MTT 母液10μL，37oC 培養(yǎng)箱孵育4h，酶標儀測定490nm 處的吸光度（OD）值。計算細胞相對存活率，細胞相對存活率=（實驗孔OD 值- 空白孔OD 值）/（對照孔OD 值- 空白孔OD 值）×100%。

1.4 WB 實驗

細胞刮收集細胞，RIPA 強裂解液冰上裂解30min，12000rpm離心15min，吸取上清，BCA 法測定蛋白濃度，將各組蛋白調(diào)至相同濃度后，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液，每孔加入40-60μg 蛋白，用12% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉1-2h 后，分別用一抗4℃孵育過夜，HRP 標記二抗室溫孵育1-2h，采用ECL 顯色液顯色。

1.5 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用Graphpad Prism 7 軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用mean ± SEM 表示，多組間比較采用單因素方差分析 (one-wayANOVA)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 番茄紅素對模型狀態(tài)下HepG2 細胞活力的保護作用

圖1 番茄紅素對模型狀態(tài)下HepG2 細胞活力的保護作用

MTT 結(jié)果顯示（圖1B），番茄紅素在80 μM 以下對HepG2 細胞活力無顯著影響（P＞0.05）；與正常組相比，PA（0.5 mM）可顯著抑制HepG2 細胞活力，而番茄紅素可劑量依賴性的增加HepG2的細胞活力（圖1D）（P＜0.05）。這提示對番茄紅素可改善PA 誘導的HepG2 細胞損傷。

2.2 番茄紅素對PA 誘導的HepG2 細胞脂質(zhì)蓄積的改善作用

肝細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積是NAFLD 的主要特征之一并可進一步引起肝細胞損傷，為了進一步探討番茄紅素對模型下HepG2 的保護作用，本實驗使用Oil Red O 和TG 檢測試劑盒檢測HepG2 細胞內(nèi)脂質(zhì)含量變化。結(jié)果顯示，番茄紅素可劑量依賴性的降低HepG2 細胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積。這提示，番茄紅素對HepG2 的保護作用可能與緩解細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積有關(guān)。

2.3 番茄紅素對HepG2 細胞內(nèi)Sirt1 和PPARα 表達的影響

Sirt1 和PPARα 是參與肝細胞脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵蛋白，為了闡明番茄紅素的降脂機制，本實驗使用Westernblot 檢測細胞Sirt1和PPARα 的表達變化。結(jié)果顯示，與正常組相比，PA 組細胞內(nèi)Sirt1 和PPARα 的表達明顯下調(diào)，番茄紅素可劑量依賴性的上調(diào)PPARα 的表達，而對Sirt1 的表達無影響。這提示，番茄紅素可能通過上調(diào)PPARα 的表達，促進細胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝，緩解PA 誘導的HepG2 細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

3 討論

NAFLD 已成為困擾人類健康的全球性問題，尋找有效治療NAFLD 的藥物是當今研究的熱點。而天然產(chǎn)物具有安全性高、自然界含量豐富、藥效顯著等特點，一直以來是尋找有效藥物的天然寶庫。番茄紅素作為一種自然界常見的天然產(chǎn)物，具有體內(nèi)外強大的抗氧化作用，其抗氧化作用是維生素E 的100 倍，是谷胱甘肽的125 倍，對各種肝損傷具有保護作用[16,17]。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可以顯著改善PA 誘導的HepG2 細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，提高細胞活力。這種效應(yīng)與上調(diào)細胞內(nèi)PPARα 的表達，促進細胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。

Sirt1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙?；福谥|(zhì)代謝和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)整中起著重要作用[18]。研究顯示，番茄粉可通過激活Sirt1 改善HFD 誘導小鼠肝脂肪變性[15]。而本實驗結(jié)果顯示，番茄紅素對Sirt1 的表達無明顯影響。這提示，番茄粉中的其他成分而非番茄紅素可上調(diào)Sirt1 的表達。為了進一步明確番茄紅素的降脂機制，我們考察了番茄紅素對PPARα 的影響。PPARα 是參與脂肪酸氧化的關(guān)鍵靶蛋白[19]。實驗結(jié)果顯示，番茄紅素可劑量依賴性的上調(diào)PPARα 的表達。綜上，番茄紅素可通過上調(diào)PPARα 的表達，促進脂質(zhì)氧化代謝，改善肝細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，增加細胞活力，進而治療NAFLD。

圖2 番茄紅素對PA 誘導的HepG2 細胞脂質(zhì)蓄積的改善作用

圖3 番茄紅素對HepG2 細胞內(nèi)Sirt1 和PPARα 表達的影響