馮雙苗,楊賀佳,袁銀花,張化蓮

1)駐馬店市中心醫(yī)院產(chǎn)科 河南駐馬店 463000 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科 鄭州 450052

近來(lái)，子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡有所下降[1-3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，LncRNA)覆蓋了人類DNA的大部分非編碼信息，占整個(gè)基因組的90%以上，是由200多個(gè)核苷酸組成的廣泛而復(fù)雜的分子群，其無(wú)完整的開(kāi)放閱讀框。LncRNA以多種方式參與癌癥的病理過(guò)程，在調(diào)控基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄和翻譯后處理方面的作用已經(jīng)在多種癌癥中得到證實(shí)[4-6]。癌易感性候選基因2(cancer susceptibility candidate 2，CASC2)是一種LncRNA，在部分癌癥中表現(xiàn)為表達(dá)水平異常降低，具有抑癌作用，包括子宮內(nèi)膜癌[7-9]。生物信息學(xué)分析結(jié)果提示CASC2與miR-155-5p可能存在靶向關(guān)系。本研究旨在探討CASC2對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移、侵襲的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞hEEC，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A、KLE、HHUA均購(gòu)自ATCC，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，胰蛋白酶購(gòu)自Sellect公司，lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自Promega公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司，Transwell小室購(gòu)自Corning公司。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9多克隆抗體均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自Santa Cruz公司，GAPDH小鼠單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。pcDNA3.1購(gòu)自Addgene公司。實(shí)驗(yàn)中所涉及的質(zhì)粒序列及引物的設(shè)計(jì)、合成均由上海吉瑪生物公司完成。

1.2 4種子宮內(nèi)膜細(xì)胞中CASC2、miR-155-5p表達(dá)的檢測(cè)采用qRT-PCR法檢測(cè)。分別收集hEEC、HEC-1A、KLE、HHUA細(xì)胞，用RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒快速合成cDNA。按PCR試劑盒說(shuō)明書操作,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)CASC2、miR-155-5p。以U6作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算CASC2、miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)水平。CASC2上游引物序列5’-GCTGATCAGAGCACATT GGA-3’，下游5’-ATAAAGGTGGCCACAACTGC-3’。miR-155-5p上游引物序列5’-GGGGTTAATGCTA ATCGTGA-3’，下游5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。U6上游引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’ ，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.3CASC2與miR-155-5p靶向關(guān)系的驗(yàn)證利用在線靶基因預(yù)測(cè)工具TargetScan(http://www.targetscan.org/ )預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CASC2與miR-155-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩者的靶向關(guān)系。含、不含結(jié)合位點(diǎn)的CASC2序列片段(CASC2-WT、CASC2-MUT)由上海吉瑪生物公司設(shè)計(jì)合成，將其克隆至熒光載體psiCHECK2，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體。采用lipofectamine2000將CASC2-WT或CASC2-MUT與miR-NC或miR-155-5p mimics共轉(zhuǎn)染入HEC-1A細(xì)胞中，24 h后按雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎熒光素酶的熒光活性，以兩者的比值表示CASC2與miR-155-5p的結(jié)合力。

1.4過(guò)表達(dá)CASC2對(duì)HEC-1A細(xì)胞遷移能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1A細(xì)胞分為3組。未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，余2組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-CASC2。用lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染。

1.4.2 細(xì)胞中CASC2表達(dá)的檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中CASC2的表達(dá)，方法同1.2。

1.4.3 細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot法。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用蛋白裂解液充分裂解，提取總蛋白，定量后用沸水浴法進(jìn)行變性處理。取變性蛋白上樣電泳，電泳結(jié)束后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉處理，將膜轉(zhuǎn)移到一抗溶液(MMP-2、MMP-9一抗稀釋度1∶1 500)中，于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，轉(zhuǎn)膜至二抗溶液(稀釋度1∶1 000)中，室溫下孵育2 h。用ECL試劑盒顯影，曝光。用Image J分析，以目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.4.4 細(xì)胞遷移、侵襲能力的檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。用無(wú)基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。用有基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：將Matrigel膠在4 ℃冰箱中過(guò)夜融化，然后按1∶3的比例與無(wú)血清培養(yǎng)基混勻，取30～50 μL平鋪于聚碳酸酯膜表面(以浸濕膜為準(zhǔn)，不宜過(guò)多)，然后將小室于37 ℃放置30 min。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度并接種至6孔板，每孔106個(gè)，常規(guī)培養(yǎng)至匯合度約70%，更換培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)。次日，取200 μL加入小室的聚碳酸酯膜上，將600 μL含血清培養(yǎng)基加入下室，過(guò)夜培養(yǎng)。取出小室，用棉簽擦去附著在下室的細(xì)胞，用PBS洗滌3次，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌2次。于400倍鏡下觀察，選取3個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.5抑制miR-155-5p對(duì)HEC-1A細(xì)胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1A細(xì)胞分為3組。未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，余2組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC和anti-miR-155-5p。48 h后，檢測(cè)細(xì)胞中miR-155-5p和MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，方法同前。

1.6過(guò)表達(dá)miR-155-5p和CASC2對(duì)HEC-1A細(xì)胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1A細(xì)胞分為3組，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-CASC2+miR-NC、pcDNA3.1-CASC2+miR-155-5p。48 h后檢測(cè)細(xì)胞中CASC2、miR-155-5p和MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，方法同前。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組細(xì)胞中CASC2、miR-155-5p表達(dá)，細(xì)胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，熒光素酶活性的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4種子宮內(nèi)膜細(xì)胞中CASC2、miR-155-5p的表達(dá)見(jiàn)表1。與hEEC細(xì)胞相比，HEC-1A、KLE、HHUA組胞中CASC2表達(dá)降低，miR-155-5p表達(dá)升高(P<0.05)。

表1 4種子宮內(nèi)膜細(xì)胞中CASC2、miR-155-5p的表達(dá)

*:組間兩兩比較，P均<0.05

2.2CASC2與miR-155-5p靶向關(guān)系的驗(yàn)證TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-155-5p與CASC2之間存在10個(gè)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-155-5p和CASC2-WT的細(xì)胞熒光素酶活性較miR-NC和CASC2-WT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞降低(表2)。

圖1 CASC2與miR-155-5p的靶向結(jié)合位點(diǎn)

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3過(guò)表達(dá)CASC2的HEC-1A細(xì)胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的變化結(jié)果見(jiàn)圖2和表3。與未轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-CASC2組CASC2表達(dá)水平升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均降低，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)亦降低(P<0.05)。

1：未轉(zhuǎn)染組:2：pcDNA3.1組；3：pcDNA3.1-CASC2組

表3 3組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞中CASC2和 MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平的比較

*：與未轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1組比較，P<0.05

2.4抑制miR-155-5p后HEC-1A細(xì)胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的變化結(jié)果見(jiàn)圖3和表4。與未轉(zhuǎn)染組和anti-miR-NC組相比，anti-miR-155-5p組細(xì)胞中miR-155-5p表達(dá)降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均降低，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)亦降低(P<0.05)。

2.5過(guò)表達(dá)miR-155-5p和CASC2后HEC-1A細(xì)胞遷移、侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的變化結(jié)果見(jiàn)圖4和表5。與pcDNA3.1-CASC2和pcDNA3.1-CASC2+miR-NC組相比，pcDNA3.1-CASC2+miR-155-5p組細(xì)胞中CASC2表達(dá)降低，miR-155-5p表達(dá)升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均升高，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平亦升高(P<0.05)。

1：未轉(zhuǎn)染組；2：anti-miR-NC組；3：anti-miR-155-5p組

表4 3組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞中miR-155-5p和 MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平的比較

*：與未轉(zhuǎn)染組和anti-miR-NC組比較，P<0.05

1：pcDNA3.1-CASC2組；2：pcDNA3.1-CASC2+miR-NC組；3：pcDNA3.1-CASC2+miR-155-5p組

圖4 3組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)

表5 3組細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中CASC2、miR-155-5p和MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的變化

*：與pcDNA3.1-CASC2組和pcDNA3.1-CASC2+miR-NC組比較，P<0.05

3 討論

癌組織中LncRNA與miRNA之間的關(guān)系多為L(zhǎng)ncRNA靶向調(diào)控下游的miRNA的表達(dá)[10-11]。miRNA通過(guò)抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者受上游調(diào)控因子的作用，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12-13]，其中包括子宮內(nèi)膜癌[14]。多項(xiàng)研究結(jié)果[7-9]表明LncRNA CASC2在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)下調(diào)。我們應(yīng)用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CASC2與miR-155-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者存在靶向關(guān)系。已有研究[15-17]證實(shí)，子宮內(nèi)膜癌患者血清和組織中miR-155表達(dá)均異常升高，且與癌癥的分期、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。Banno等[18]通過(guò)分析子宮內(nèi)膜癌組織差異miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p為其中表達(dá)異常升高的miRNA之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中CASC2表達(dá)下調(diào)，miR-155-5p表達(dá)上調(diào)。

細(xì)胞遷移和侵襲是腫瘤細(xì)胞的特征，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分降解和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有關(guān)[19]。MMP-2、MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要組成部分，它們可以水解ECM，可促使細(xì)胞轉(zhuǎn)移[20]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CASC2和抑制miR-155-5p均可下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)，降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；而過(guò)表達(dá)miR-155-5p可逆轉(zhuǎn)CASC2對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用。推測(cè)CASC2可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)節(jié)miR-155-5p的表達(dá)，參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究為體外實(shí)驗(yàn)，下一步將在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果。

綜上所述，CASC2可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，其機(jī)制與靶向負(fù)調(diào)節(jié)miR-155-5p表達(dá)有關(guān)，這為子宮內(nèi)膜癌的診斷、治療提供了參考。