王湘琦，趙超然，熊愛兵

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院燒傷整形外科，瀘州 646000

糖尿病足潰瘍（diabetes foot ulcer，DFU）是常見的糖尿病慢性合并癥之一，是導致糖尿病患者截肢致殘的主要原因。潰瘍的發(fā)生被認為是截肢的前兆，而下肢截肢經(jīng)常會導致糖尿病患者死亡，70%的患者在截肢手術(shù)后5年內(nèi)死亡[1-2]。DFU的高截肢率和高死亡率，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭帶來了經(jīng)濟負擔。因此，預防和治療DFU十分重要。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）屬于血小板濃縮物，含有大量高濃度的生長因子，可促進軟組織的修復。前期有學者研究發(fā)現(xiàn)，PRP對于糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合有獨特的優(yōu)勢和效果[3]，在統(tǒng)計學上有更高的愈合率和更低的并發(fā)癥發(fā)生率[4]。低氘水（deuterium depleted water，DDW）為氘體積分數(shù)低于0.015%的水[5]，有一系列生物學效應，如抗氧化、防衰老、抗抑郁、抗輻射、保護心血管系統(tǒng)、降血糖、抗腫瘤等作用[6]。本實驗擬觀察DDW聯(lián)合PRP在大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物

健康清潔級雄性 SD 大鼠120只，質(zhì)量160～200 g，購自遼寧長生生物股份有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2015-0001，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要儀器與試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、檸檬酸、檸檬酸三鈉、葡萄糖均購自北京索萊寶公司；水合氯醛（源葉生物）；大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、組織金屬蛋白酶抑制物 -1（TIMP-1）Elisa試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；高速冷凍離心機（Eppendorf）；酶標儀（Rayto，RT-6100）；洗板機（Tianshi，988洗板機）；電熱恒溫箱（武漢-恒蘇凈科學儀器有限公司）；移液器（Finnpipette，20～200 μL）；羅氏血糖儀（活力型）、羅氏血糖試紙、飛科剃刀；高脂高糖飼料（67%大鼠維持飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供）；大鼠普通飼料（成都達碩生物科技有限公司）；低氘水（瀘州哈羅德健康科技有限公司）。本實驗用水符合三級水標準。

1.3 動物分組及模型的建立

健康清潔級雄性SD大鼠120只，適應性喂養(yǎng)1周后，選100只隨機分為正常對照組（n=20）和糖尿病組（n=80），分別稱取2組大鼠體質(zhì)量，測隨機血糖。剩余20只大鼠用于制取PRP，普通飼料飼養(yǎng)，不參與造模與分組。

1.3.1 糖尿病大鼠潰瘍模型的建立及分組 糖尿病組大鼠予以高脂高糖飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)4周后，禁食12 h（不禁水），給予1% 的STZ 溶液（臨用前用0.1 mol/L、pH4.5的檸檬酸 - 檸檬酸鈉緩沖液配制，冰浴、避光操作）單次腹腔注射（30 mg/kg），7 d后采用尾靜脈采血法測大鼠隨機血糖，血糖≥16.7 mmol/L表示糖尿病模型大鼠建立成功[7]。成模后以7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g）腹腔注射進行麻醉，備皮消毒，在背部制作約3 cm×3 cm的正方形創(chuàng)面，深達筋膜。拍照后醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面，膠帶包扎固定。將造模成功[8-9]的72只大鼠隨機分為糖尿病模型組（B組）、PRP組（C組）、低氘水組（D組）及低氘水聯(lián)合PRP組（E組），每組各18只。

1.3.2 正常大鼠潰瘍模型建立 正常對照組（A組）繼續(xù)予普通飼料喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，不禁水，在相同操作條件下注射等體積的檸檬酸 - 檸檬酸鈉緩沖液，7 d后采用尾靜脈采血法測血糖。以7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）腹腔注射，備皮消毒，在背部制作約3 cm×3 cm的正方形創(chuàng)面，深達筋膜。拍照后醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面，膠帶包扎固定。

1.4 PRP的制備

采用改良Landesberg法[10]制作。每次取2～3只大鼠，稱重麻醉后，用預先裝有1 mL檸檬酸葡萄糖溶液（ACD抗凝劑）的5 mL真空離心管及一次性靜脈采血針，直視下從每只大鼠腹主動脈取血約10 mL（約5 mL血裝一離心管），搖勻后，取1 mL全血進行全血細胞分析，測得血小板計數(shù)為646×109。第一次以200×g在4 ℃條件離心15 min，離心后管內(nèi)全血分為3層，下層為紅細胞，上層為上清液，中間交界層即富含血小板。在劃分中層與下層兩部分的線下方2 mm處標記，移取該點以上的全部內(nèi)容物[11]至另一不裝有抗凝劑的空白離心管，搖勻，再以500×g在4 ℃條件離心10 min，得到2個部分，上層即貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP），下層為含有少量紅細胞、血漿和血小板混合物，即PRP。用移液槍吸取上份PPP，即獲得PRP，經(jīng)全血細胞分析測得血小板計數(shù)為 4 296×109。

1.5 各組干預方案

A組和B組：生理鹽水灌胃，飲用普通水；潰瘍局部常規(guī)消毒后涂抹生理鹽水，然后無菌紗布覆蓋。C組：生理鹽水灌胃，飲用普通水；潰瘍局部常規(guī)消毒后涂抹PRP，然后用無菌紗布覆蓋。D組：低氘水灌胃，飲用低氘水；潰瘍局部常規(guī)消毒后涂抹生理鹽水，然后無菌紗布覆蓋。E組：低氘水灌胃，飲用低氘水；潰瘍局部常規(guī)消毒后涂抹PRP，然后用無菌紗布覆蓋。各組灌胃量均為0.01 mL/ （g·d）[12]。每只大鼠均單籠飼養(yǎng)，于術(shù)后第1日開始換藥，每日更換墊料1～2次，換藥1次，并祛除創(chuàng)面硬痂。PRP每隔1 d使用1次，PRP及生理鹽水每次每創(chuàng)面使用量均為100 μL。

1.6 樣本獲取及指標檢測

分別于潰瘍造模后的第3日、第7日及第14日，每組各隨機選取6只大鼠，測血糖（早晨9時）后麻醉，照相并觀察潰瘍愈合情況。取創(chuàng)面及周圍5 mm內(nèi)組織，將一半肉芽組織進行蘇木精-伊紅染色（H-E染色），觀察組織病理學改變；另一半立即置于液氮中冷卻，隨后-80 ℃保存，用于各組大鼠創(chuàng)面組織MMP-9、TIMP-1蛋白含量檢測。

1.6.1 潰瘍大鼠創(chuàng)面恢復情況 ①大體觀察：觀察創(chuàng)面的基本情況，拍照后用Image J圖像軟件進行潰瘍面積的測量，以創(chuàng)面愈合率作為評價大鼠潰瘍愈合情況的指標。創(chuàng)面愈合率= （創(chuàng)面初始面積-創(chuàng)面當前面積） /初始面積×100%。②組織病理形態(tài)學觀察：取創(chuàng)面及周圍5 mm內(nèi)組織，進行H-E染色，使用光學顯微鏡觀察創(chuàng)面的組織形態(tài)學變化，主要觀察創(chuàng)面肉芽組織、新生毛細血管、成纖維細胞及膠原等的變化。

1.6.2 創(chuàng)面組織MMP-9和TIMP-1的檢測 取創(chuàng)面及周圍5 mm內(nèi)組織，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測創(chuàng)面組織MMP-9和TIMP-1的含量。所有指標均按照試劑盒說明進行操作。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 20. 0 軟件進行統(tǒng)計學分析，定量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

正常對照組大鼠皮毛光亮，精神良好，皮脂豐厚。糖尿病組大鼠在STZ注射后精神狀態(tài)變得稍差，皮毛粗糙、萎黃，且易脫毛，飲水量、飲食量、尿量明顯增加；隨著時間變化，體質(zhì)量較正常對照組明顯減輕，皮脂變薄。

2.2 正常對照組及糖尿病組大鼠體質(zhì)量及血糖結(jié)果的比較

在適應性喂養(yǎng)1周后，2組大鼠體質(zhì)量無明顯差異；糖尿病組大鼠經(jīng)高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，體質(zhì)量增長略比正常對照組大鼠快；正常對照組大鼠在經(jīng)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液注射7 d后體質(zhì)量稍有增長，而糖尿病組大鼠在經(jīng)STZ注射7 d后體質(zhì)量反而降低（表1）。

表1 造模前后大鼠體質(zhì)量變化（x—±s，g）Tab 1 Changes in body weight of rats before and after modeling (x—±s, g)

初始狀態(tài)下，糖尿病組大鼠的隨機血糖與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；糖尿病組大鼠經(jīng)高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，其血糖較正常對照組稍高，但差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在STZ/檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液注射7 d后，糖尿病組大鼠血糖較正常對照組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明高脂飼料喂養(yǎng)配合STZ誘導的2型糖尿病大鼠模型建立成功（表 2）。

表2 造模前后大鼠血糖水平變化（x—±s，mmol/L）Tab 2 Changes of blood glucose level in rats before and after modeling (x—±s, mmol/L)

2.3 各糖尿病組大鼠血糖變化

A、B、C組在各干預時間點的隨機血糖水平與干預前相比，差異無統(tǒng)計學意義；在D組及E組可觀察到，在低氘水干預后大鼠隨機血糖開始緩慢下降，在干預第14 日后較干預前明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。

表3 干預后不同時間點各組大鼠隨機血糖變化（x—±s，n=6，mmol/L）Tab 3 Random blood glucose changes in rats of different groups at different time points after intervention (x—±s, n=6, mmol/L)

2.4 各組大鼠創(chuàng)面恢復情況及組織病理形態(tài)學觀察

各組大鼠創(chuàng)面均無明顯感染，有不同程度滲出、水腫及少量出血，隨著時間推移各創(chuàng)面均在逐步愈合（圖1）。在干預第3日，H-E染色結(jié)果顯示：A組炎癥細胞浸潤明顯，可見少量新生毛細血管及成纖維細胞；B組可見少量炎癥細胞、成纖維細胞及新生毛細血管；C組可見炎癥細胞浸潤，有少量新生毛細血管及成纖維細胞；D組可見炎癥細胞浸潤，有少量新生毛細血管及成纖維細胞；E組可見炎癥細胞浸潤，伴少量新生毛細血管及成纖維細胞。在干預第7日，H-E染色結(jié)果顯示：A組可見大量新生毛細血管及成纖維細胞，有少量膠原纖維，仍可見較多炎癥細胞；B組可見炎癥細胞浸潤，新生毛細血管較其他組少，有少量成纖維細胞；C組見較多的新生毛細血管及成纖維細胞，有少量膠原纖維；D組可見較多的新生毛細血管及成纖維細胞，有少量膠原纖維；E組可見成纖維細胞及新生毛細血管增多，有少量膠原纖維，炎癥細胞減少。在干預第14日，H-E染色結(jié)果顯示：A組可見大量膠原纖維，少量新生毛細血管、成纖維細胞及炎癥細胞；B組可見膠原纖維，少量成纖維細胞及新生毛細血管；C組可見較多膠原纖維及新生毛細血管，伴少量炎癥細胞浸潤；D組可見較多膠原纖維及新生毛細血管，伴少量炎癥細胞浸潤；E組可見大量膠原纖維及較多的新生小動脈和小靜脈。各糖尿病組創(chuàng)面炎癥反應均較正常對照組慢；E組肉芽成熟效果較其余3個糖尿病組快，在各干預組中效果最佳，新生血管及成纖維細胞出現(xiàn)時間早且數(shù)量多，為創(chuàng)面修復提供了前提條件（圖2）。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面愈合情況的比較Fig 1 Comparison of wound healing in each group of rats

圖2 各組大鼠創(chuàng)面組織H-E染色（×200）Fig 2 H-E staining of wound tissue in each group of rats (×200)

2.5 各組大鼠愈合率的比較

干預第3日：各糖尿病組大鼠創(chuàng)面愈合率均明顯低于正常對照組（A組）（P＜0.05）；C組、D組及E組創(chuàng)面愈合率均高于B組（P＜0.05），但兩兩之間的差異均無統(tǒng)計學意義；各組創(chuàng)面愈合率由高到低依次為A組＞E組＞C組＞D組＞B組。干預第7日：A組創(chuàng)面愈合率大于B組、C組及D組（P＜0.05）；E組愈合率雖低于A組，但2組差異無統(tǒng)計學意義；各組創(chuàng)面愈合率由高到低依次為A組＞E組＞D組＞C組＞B組。干預第14日：A組創(chuàng)面愈合率大于B組、C組及D組（P＜0.05）；E組愈合率雖低于A組，但2組差異無統(tǒng)計學意義；各組創(chuàng)面愈合率由高到低依次為A組＞E組＞C組＞D組＞B組（表4）。

表4 干預后不同時間點各組大鼠創(chuàng)面愈合率的變化（x—±s，n=6，%）Tab 4 Changes of wound healing rate in rats of different groups at different time points after intervention (x—±s, n=6, %)

2.6 各組大鼠創(chuàng)面組織MMP-9含量的比較

各糖尿病組大鼠創(chuàng)面組織中MMP-9含量在觀察的各時間點均明顯高于正常對照組（A組）。C組、D組及E組在干預3 d后，MMP-9含量較B組明顯降低（P＜0.05）；干預3 d后E組MMP-9含量較C組及D組明顯降低，7 d后差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表5）。

表5 干預后不同時間點各組大鼠創(chuàng)面組織MMP-9含量的變化（x—±s，n=6，ng/g）Tab 5 Changes of MMP-9 content in wound tissues of rats in different groups at different time points after intervention (x—±s, n=6, ng/g)

2.7 各組大鼠創(chuàng)面組織TIMP-1含量的比較

各糖尿病組大鼠創(chuàng)面組織中TIMP-1含量在各時間點均低于正常對照組（A組），而C組、D組及E組干預后TIMP-1含量均較B組升高（均P＜0.05）。E組干預3 d后TIMP-1含量升高較C組及D組明顯（P＜0.05）；在干預14 d后，與A組差異無統(tǒng)計學意義（表6）。

表6 干預后不同時間點各組大鼠創(chuàng)面組織TIMP-1含量的變化（x—±s，n=6，ng/g）Tab 6 Changes of TIMP-1 content in wound tissue of rats in different groups at different time points after intervention (x—±s, n=6, ng/g)

3 討論

皮膚是人體最大的器官之一，主要有3個關(guān)鍵作用：屏障功能、感覺功能、代謝功能。皮膚受損時，會經(jīng)歷傷口愈合的過程。傷口愈合的4個階段是炎癥、血管生成、再上皮化和重塑。由于各種原因，一些傷口修復減慢或中斷，這些傷口被稱為慢性傷口[13]。糖尿病慢性足潰瘍是糖尿病患者較嚴重且常見的并發(fā)癥，是常見的慢性傷口之一，在糖尿病人群中的終身發(fā)病率高達15%[14]。盡管發(fā)病率很高，但目前的治療方案仍然有限。常見的外科治療方法主要是清創(chuàng)，隨后換藥、控制感染和血糖水平。盡管采用了各種綜合方法，但患者并發(fā)癥發(fā)生率和截肢率仍然很高[15]。

2型糖尿病大鼠模型已較成熟。有研究[16-17]表明，STZ對胰島β細胞具有高度選擇性毒性作用，通過自由基損傷胰島β細胞，使其胰島素的合成減少，進而引發(fā)糖尿病。通過高脂高糖喂養(yǎng)1～2個月誘導大鼠胰島素抵抗后，再加小劑量一次性腹腔注射STZ來損傷胰島功能，能引起血糖升高，模擬2型糖尿病發(fā)病的過程。張玉領(lǐng)等[18]發(fā)現(xiàn)高脂高糖喂養(yǎng)4周后，大鼠出現(xiàn)明顯的肥胖及胰島素抵抗，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg，可成功制備2型糖尿病大鼠模型，其成模率高，模型穩(wěn)定，無動物死亡，更適用于2型糖尿病的相關(guān)研究。

PRP是全血經(jīng)離心后獲得的高濃度血漿，富含多種生長因子，可促進軟組織的修復。研究[4,19-20]表明，PRP治療DFU有較好的療效。本次實驗也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PRP干預后的糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合率較模型組高。低氘水能夠降低胰島素抵抗性、降低糖尿病患者血糖含量[12,21-22]。Wang等[23]報道，低氘水可促進醌氧化還原酶1（NADPH: quinone oxidoreductase-1，NQO1）的表達，從而抑制MMP-9的表達。本研究也發(fā)現(xiàn)，低氘水干預組大鼠隨機血糖在干預14 d后明顯下降，在各個時間點的創(chuàng)面愈合率較糖尿病模型組高；說明低氘水可降低糖尿病大鼠隨機血糖，對糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合有促進作用。

研究[24]表明，糖尿病患者足部傷口中，MMPs表達增加，其抑制因子TIMPs表達減少，導致傷口難以愈合。MMPs是一組具有共同生物化學性質(zhì)的可降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM） 的鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶， 是參與 ECM 降解的主要蛋白酶之一；TIMPs 是 MMPs的特異性抑制因子，能調(diào)節(jié) MMPs的活性。MMP-9是金屬蛋白酶家族中相對分子質(zhì)量最大的酶，可作用較廣泛的底物，包括 Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ 型膠原，明膠，纖連蛋白，玻連蛋白及層粘連蛋白等，對這些底物起著降解作用[25]。MMP-9通過分解ECM成分參與傷口的愈合過程。糖尿病患者動脈中高含量的MMP-9能使中性粒細胞和巨噬細胞表達增強，這2種細胞是主要的炎癥反應細胞，因此導致DFU延遲愈合[26]。TIMPs是 MMPs 的內(nèi)源性抑制劑，可抑制MMPs 活性，刺激細胞分裂，結(jié)合ECM，抑制血管形成，誘導細胞凋亡[25]。TIMP-1 對 MMP-9 有直接的抑制作用，是 MMP-9的特異性抑制劑。TIMP-1與活性 MMP-9 形成非共價復合物，通過抑制MMP-9活性來減少ECM的降解。鄭潔等[25]的研究表明，MMP-9與糖尿病潰瘍的愈合密切相關(guān)，且MMP-9/TIMP-1有望成為未來DFU治療的新靶點。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠創(chuàng)面MMP-9水平高于空白對照組，而經(jīng)PRP、低氘水、PRP聯(lián)合低氘水治療后MMP-9明顯降低，且低氘水聯(lián)合PRP治療組干預14 d后效果最明顯；糖尿病組大鼠創(chuàng)面TIMP-1水平低于空白對照組，而經(jīng)PRP、低氘水、PRP聯(lián)合低氘水治療后TIMP-1明顯升高，且低氘水聯(lián)合PRP治療組干預14 d后效果最明顯。

綜上所述，低氘水聯(lián)合PRP對大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合有顯著的促進作用，其可能與調(diào)控MMPs的表達有關(guān)，即通過提高潰瘍創(chuàng)面TIMP-1表達，從而抑制MMP-9的表達，減少ECM的降解。