曾群雄 ，鄧 軍 ，沈 南

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海市風(fēng)濕病學(xué)研究所，上海200127；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院中澳個體化自身免疫病研究中心，上海200127

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是腸道黏膜內(nèi)免疫反應(yīng)的異常激活導(dǎo)致的。多種免疫細(xì)胞亞群參與IBD發(fā)病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn′s disease，CD）等慢性復(fù)發(fā)性胃腸道炎癥[1-3]。目前，許多研究證明CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的異?；罨cIBD患者腸道黏膜內(nèi)炎癥反應(yīng)有關(guān)[1-2,4-5]。這些促炎癥細(xì)胞通過分泌趨化因子、促炎細(xì)胞因子及效應(yīng)性分子參與和維持炎癥反應(yīng)，加重腸道破壞[1-2,6]。調(diào)節(jié)性細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、分泌白介素（IL） -10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞抑制炎癥反應(yīng)，減輕腸道炎癥[7-8]。即便如此，IBD的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，有待進(jìn)一步研究[9]。

近年來，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICI），如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）阻斷抗體（Ipilimumab）、程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）阻斷抗體（Nivolumab/Pembrolizumab）或程序性死亡受體配體1（PD-1 ligand，PD-L1）的阻斷抗體對腫瘤患者的療效顯著[10]。但接受ICI治療后，部分腫瘤患者出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫相關(guān)不良事件（immune-related adverse events，irAEs）， 自 Nivolumab、Pembrolizumab 和Atezolizumab等藥物上市以來，有關(guān)ICI治療后致死的報(bào)道不斷增加。Ipilimumab單藥治療時，致死性irAEs中結(jié)腸炎/腹瀉非常普遍?？筆D-1/PD-L1單藥使用也可以導(dǎo)致嚴(yán)重的結(jié)腸炎，聯(lián)合療法致死數(shù)量顯著增加。以上研究表明，應(yīng)對接受ICI治療的患者引起的致死性irAEs的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行全面評估，深入研究胃腸道免疫相關(guān)不良事件的發(fā)生機(jī)制。ICIs治療的免疫原理是重新激活耗竭的CD8+T細(xì)胞，增強(qiáng)效應(yīng)分子的表達(dá)以殺傷腫瘤細(xì)胞。因而，我們推測激活的CD8+T細(xì)胞參與胃腸道免疫相關(guān)不良反應(yīng)。葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，符合人類IBD患者腸道炎癥和發(fā)病機(jī)制的主要特征，也是目前研究腸道炎癥使用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動物模型[11-12]。因此，本研究擬使用DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型，初步探討CD8+T細(xì)胞在結(jié)腸炎中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SPF級C57BL/6野生型（WT）雄性小鼠46只，鼠齡8～10周，體質(zhì)量24～26 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0005。將WT小鼠隨機(jī)進(jìn)行分組：未造模組（n=6）、經(jīng)2%（質(zhì)量濃度，下同）DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎組（n=14）、3% DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎組（n=16）和4%DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎組（n=10）。

B6.129S2-Cd8atm1Mak/J （編號002665） CD8敲除小鼠（簡稱CD8-/-小鼠）34只，性別、鼠齡與野生型小鼠相同，體質(zhì)量25～27 g，由美國The Jackson Laboratory提供。CD8-/-小鼠分組：2% DSS誘導(dǎo)組（n=14）、3% DSS誘導(dǎo)組（n=12）和4%DSS誘導(dǎo)組（n=8）。

實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物屏障設(shè)施內(nèi)，動物使用許可證號為SYXK（滬）2016-0009。小鼠飼以60Co輻照殺菌飼料，自由進(jìn)食。飼養(yǎng)條件：溫度22～24 ℃，空氣相對濕度40%～60%，光照周期為12 h/12 h。本研究的動物飼養(yǎng)條件符合相應(yīng)實(shí)驗(yàn)動物等級標(biāo)準(zhǔn)，所有動物相關(guān)操作均按照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的規(guī)定執(zhí)行。

1.2 主要試劑和儀器

DSS（MP Biomedicals，美國），4%多聚甲醛（谷歌生物，中國），QuantStudio 7熒光定量PCR儀（ABI，美國），TRIzol試劑（Invitrogen，美國），超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國），光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR熒光定量PCR試劑盒（Takara，日本），Aperio切片掃描儀（Leica，德國），EVOS FL細(xì)胞成像系統(tǒng)（Thermo Fisher，美國），BZX710熒光顯微鏡（Keyence，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 急性結(jié)腸炎模型的誘導(dǎo) 用高壓滅菌的雙蒸水配制質(zhì)量濃度為2%～4%的DSS溶液，WT小鼠和CD8-/-小鼠連續(xù)飼喂DSS 溶液7 d，然后更換為正常飲水喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，監(jiān)測小鼠存活情況，繪制生存曲線至誘導(dǎo)后第14日。每日測量小鼠體質(zhì)量。疾病活動指數(shù)（diseases activity index，DAI）為以下3項(xiàng)參數(shù)的平均值：①糞便稠度（無腹瀉為0分，糞便變軟為2分，明顯腹瀉為4分）。②血便（無出血為0分，可疑陽性為2分，肉眼可見血便為4分）。③體質(zhì)量變化（無體質(zhì)量減輕為0分，體質(zhì)量減輕1%～5%為1分，體質(zhì)量減輕6%～10%為2分，體質(zhì)量減輕11%～20%為3分，體質(zhì)量減輕超過20%為4分）。

1.3.2 結(jié)腸組織病理觀察和評分 2%DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎后第10日，收集WT小鼠和CD8-/-小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸，用4%多聚甲醛固定24 h后石蠟包埋，連續(xù)切片（6 μm），然后用蘇木精 - 伊紅（H-E）染色。小鼠組織病理學(xué)評分采用雙盲方法[13]，觀察2%DSS處理后WT小鼠和CD8-/-小鼠腸道炎癥反應(yīng)程度，包括隱窩結(jié)構(gòu)破壞和喪失（正常為0分，隱窩位于黏膜上為1分，嚴(yán)重隱窩結(jié)構(gòu)異常為2分，整個隱窩丟失為3分）、炎癥細(xì)胞浸潤程度（正常為0分，明顯炎癥浸潤為3分）、肌層增厚（無增厚為0分，明顯的肌層增厚為2分，肌層透壁性壞死為3分）、隱窩膿腫（不存在為0分，存在為1分，中度為2分，重度為3分）和杯狀細(xì)胞耗竭（不存在為0分，存在為1分，中度為2分，重度為3分）。小鼠組織病理學(xué)評分為以上3項(xiàng)評分的平均值。

1.3.3 實(shí)時熒光定量PCR 2%DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎后第10日，收集小鼠中段結(jié)腸組織，于液氮速凍后通過酚-氯仿法提取總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑說明書要求，取400 ng RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。促炎癥和抑炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平用SYBR染料和實(shí)時熒光定量PCR儀檢測。根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR原始檢測結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt方法進(jìn)行定量分析?；蛞镄蛄幸姳?。

1.4 免疫熒光染色觀察結(jié)腸黏膜固有層中CD8+ T細(xì)胞浸潤情況

2% DSS誘導(dǎo)后第10 日，收集小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，用封閉液（1% BSA）封閉60 min，一抗（大鼠抗小鼠CD8，Abcam）4 ℃孵育過夜，二抗使用驢抗大鼠Alexafluor 488（Thermo Fisher）。細(xì)胞核用DAPI染色。采用EVOS FL細(xì)胞成像系統(tǒng)和BZ-X710熒光顯微鏡拍照，采用Photoshop CS4（Adobe）分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料采用x—±s表示。通過對數(shù)秩檢驗(yàn)（Log Rank）進(jìn)行生存曲線分析，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR

2 結(jié)果

2.1 DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎發(fā)病情況

2% DSS誘導(dǎo)后第3～10日，WT小鼠體質(zhì)量持續(xù)急劇下降，但CD8-/-小鼠體質(zhì)量在第3～8日下降速度較慢，且在第9日呈現(xiàn)上升趨勢（圖1A）。野生型小鼠在誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎后表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的結(jié)腸炎癥狀，包括精神不振、肛門粘連、嚴(yán)重的腹瀉和大量血便。CD8-/-小鼠DAI較WT小鼠明顯降低（圖1B）。結(jié)腸長度縮短通常被視為結(jié)腸損傷的宏觀參數(shù)，WT小鼠結(jié)腸長度比CD8-/-小鼠減少近30%（圖1C）。H-E染色觀察結(jié)果顯示，WT小鼠腸道病理改變較CD8-/-小鼠嚴(yán)重，結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)幾乎全部喪失、黏膜下層伴隨大量淋巴細(xì)胞浸潤。與WT小鼠比較，CD8-/-小鼠腸道黏膜結(jié)構(gòu)較完整，組織病理學(xué)評分顯著降低（圖1D、1E）。

2.2 高濃度 DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠存活情況

WT和CD8-/-小鼠經(jīng)4%DSS誘導(dǎo)腸炎后，均出現(xiàn)腹瀉和血便，體質(zhì)量明顯下降。CD8-/-小鼠體質(zhì)量下降幅度較?。▓D2A），結(jié)腸長度較WT小鼠長（圖2B）。WT組小鼠在第7日全部死亡，CD8-/-組全部存活（圖2C）。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎嚴(yán)重程度可隨著DSS給藥時間及濃度增加而增加，將小鼠體質(zhì)量減輕超過初始體質(zhì)量30%視為應(yīng)激指標(biāo)，此時應(yīng)達(dá)到動物實(shí)驗(yàn)倫理終點(diǎn)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用3% DSS評估CD8-/-小鼠存活情況。結(jié)果顯示，WT小鼠存活率僅為37.5%（6/16），而CD8-/-小鼠存活率為66.7%（8/12），約為WT小鼠存活率的2倍（圖2D）。

圖1 2%DSS誘導(dǎo)后小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度和組織病理學(xué)變化Fig 1 Weight loss, colon shortening and histopathology changes in 2% DSS-induced mice

圖2 高濃度DSS誘導(dǎo)后小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度變化及存活情況Fig 2 Changes of weight, colon length and survival rate of mice induced by high concentration of DSS

2.3 CD8-/-小鼠結(jié)腸炎癥因子表達(dá)變化

2% DSS誘導(dǎo)腸炎后第10 日，RT-PCR檢測結(jié)果（圖3）顯示：WT小鼠結(jié)腸組織中的促炎癥細(xì)胞因子Il1b、Il6、Il17a、Ifng和TnfmRNA表達(dá)水平顯著高于CD8-/-小鼠（均P＜0.05）。2組抑炎癥細(xì)胞因子Il10、Tgfb1和Foxp3mRNA表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖3 CD8-/-小鼠和WT小鼠結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平（n=8）Fig 3 Expression of inflammatory cytokines in colon tissues of CD8-/- mice and WT mice (n=8)

2.4 DSS誘導(dǎo)后結(jié)腸黏膜固有層中CD8+ T細(xì)胞浸潤情況

使用2%DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后第10日，WT小鼠免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示：WT小鼠腸道固有層中可以見到浸潤大量的CD8+T細(xì)胞（n=10），與未造模組（n=6）小鼠比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），見圖4。

圖4 DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜固有層中CD8+ T細(xì)胞浸潤情況Fig 4 CD8+ T cells infiltration in colon lamina propria of mice with DSS-induced colitis

3 討論

作為適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)的重要組成部分，CD8+T細(xì)胞在腫瘤和慢性感染中的作用和機(jī)制被廣泛研究；而對于其在慢性炎癥和自身免疫性疾病中的作用關(guān)注較少，特別是CD8+T細(xì)胞在結(jié)腸炎中的作用鮮有報(bào)道[14]。IBD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，通常認(rèn)為與遺傳、免疫功能紊亂、腸道屏障功能破壞、組織損傷等有關(guān)[1,5]。本研究結(jié)果提示，在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，CD8+T細(xì)胞浸潤到結(jié)腸黏膜固有層，CD8-/-小鼠存活率升高，體質(zhì)量降低幅度較小。結(jié)腸組織病理學(xué)改變顯示，CD8-/-小鼠腸道黏膜破壞減輕，隱窩結(jié)構(gòu)相對完整，浸潤到腸道中炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，炎癥程度減輕。

在接受ICI治療的腫瘤患者中，發(fā)生胃腸道免疫相關(guān)iRAEs者，經(jīng)胃腸鏡活檢發(fā)現(xiàn)胃和十二指腸上皮內(nèi)CD8+T細(xì)胞浸潤顯著增多，提示為CD8+T細(xì)胞參與PD-1阻斷治療導(dǎo)致的胃腸炎不良事件[15]。本研究中，通過DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型發(fā)現(xiàn)，WT小鼠結(jié)腸黏膜固有層中CD8+T細(xì)胞浸潤數(shù)量顯著增加，小鼠腸炎癥狀較重，而在CD8-/-小鼠急性結(jié)腸炎癥狀減輕。Smillie等[16]發(fā)現(xiàn)，與健康人群比較，IBD患者腸道黏膜中產(chǎn)生IL-17的CD8+T細(xì)胞會隨著疾病的發(fā)生和發(fā)展而增加，而且是黏膜樣本中產(chǎn)生腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和IL-17的主要來源，提示這群CD8+T細(xì)胞可能參與并造成腸道黏膜的組織損傷和結(jié)構(gòu)破壞。此外，IBD患者外周血中CD8+T細(xì)胞PD-1、CTLA-4等免疫抑制性基因模塊的高表達(dá)，預(yù)示著更好的臨床轉(zhuǎn)歸和較低的疾病復(fù)發(fā)概率[17]。并且，IBD患者外周血CD8+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征可以作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于疾病預(yù)后評估，從而指導(dǎo)IBD患者的臨床治療策略[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，在IBD 患者的腸道中CD8+T細(xì)胞仍能夠被T細(xì)胞信號激活并表達(dá)高水平的顆粒酶B、TNF-α和干擾素γ等效應(yīng)分子，提示這些細(xì)胞可能是具有效應(yīng)表征的細(xì)胞亞群[20]。可見，CD8+T細(xì)胞具有可塑性，并且在腸道黏膜穩(wěn)態(tài)與炎癥中的作用非常復(fù)雜，亟待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在DSS誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎模型中，WT小鼠造模后CD8+T細(xì)胞浸潤到結(jié)腸黏固有層中并且加重結(jié)腸炎病理改變，CD8-/-小鼠存活率升高，體質(zhì)量降低幅度較小，結(jié)腸破壞較輕，結(jié)腸組織中促炎癥因子水平降低，證明了CD8+T細(xì)胞在急性結(jié)腸炎中的致病性。但是，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。