于明懂，李佩，于泳浩，盧悅淳，陳會(huì)敏，王新，謝克亮

膿毒癥可以造成嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，引起嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙，即膿毒癥相關(guān)性腦?。╯epsis-associated encephalopathy，SAE）。對(duì)膿毒癥相關(guān)性腦病的機(jī)制研究和治療措施是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)。既往研究表明吸入氫氣可以明顯減輕膿毒癥時(shí)腦功能損傷，改善認(rèn)知功能，其機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)［1］。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，在腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)時(shí)，DNA 甲基化水平也發(fā)生改變，引起嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙［2-4］。改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)的DNA 甲基化狀態(tài)，可抑制腦組織的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善認(rèn)知功能［5-6］。因此，推測(cè)通過(guò)調(diào)控DNA 甲基化狀態(tài)來(lái)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是氫氣治療膿毒癥相關(guān)性腦病的機(jī)制之一。本研究擬探討吸入氫氣時(shí)膿毒癥小鼠海馬組織的DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生的變化，為氫氣治療膿毒癥相關(guān)性腦病研究提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性C57BL/6 小鼠54 只，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，均由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于自然晝夜交替的通風(fēng)環(huán)境，自由飲水、飲食。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組（均n=18）：假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥組（Sepsis組）和氫氣治療組（Sepsis+H2組）。

1.2 主要試劑與儀器 通用型柱式基因組提取試劑盒（北京康為世紀(jì)）；全基因組甲基化定量檢測(cè)試劑盒（Epigentek 公司，美國(guó)）；Trizol試劑（Molecular Research 公司，美國(guó)）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo 公司，美國(guó)）；SYBR Green Master Mix試劑盒（Thermo公司，美國(guó)）；兔源DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和GAPDH 一抗均購(gòu)自Abcam 公司（英國(guó)）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（Sigma公司，美國(guó)）；GCH-500高純氫氣發(fā)生器（天津同普分析儀器科技有限公司）；PG610氫氣檢測(cè)儀（河南英特電器設(shè)備公司）；多功能酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司，美國(guó)）；Piko Real96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)（Thermo 公司，美國(guó)）。

1.3 膿毒癥模型的制備 采用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法建立小鼠膿毒癥模型［7］，以2%水合氯醛15 mL/kg 腹腔注射麻醉，腹正中線切開，Sepsis組和Sepsis+H2組用手術(shù)縫線在回盲瓣下方盲腸近段1/4 處結(jié)扎盲腸，用20G 無(wú)菌針頭將被結(jié)扎盲腸貫穿穿孔，擠出盲腸內(nèi)容物約0.3 mL，將盲腸及其內(nèi)容物還納腹腔后縫合腹壁切口。Sham 組不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔，其余操作同上。

1.4 干預(yù)和治療 參考文獻(xiàn)［8］的方法，使用GCH-500高純氫氣發(fā)生器生成氫氣，將各組小鼠于手術(shù)后1 h和6 h放入有進(jìn)氣口和出氣口的密封樹脂箱子內(nèi)，采用PG610氫氣檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)箱內(nèi)氫氣濃度。Sepsis+H2組吸入用空氣混合的2%氫氣1 h，其他2 組小鼠只置于相同環(huán)境中，不吸入氫氣。在手術(shù)結(jié)束時(shí)各組小鼠均于頸部皮下給予生理鹽水5 mL/100 g進(jìn)行液體治療，腹腔注射頭孢曲松30 mg/kg和克林霉素25 mg/kg，每6 h注射1次，共3 d［9］。于術(shù)后1、3、7 d通過(guò)頸椎脫臼的方法處死小鼠（每個(gè)時(shí)點(diǎn)6只），沿腹部正中切口，暴露心臟，在右心耳處用一鈍頭注射器針頭送至主動(dòng)脈根部，用預(yù)配制的4 ℃肝素化生理鹽水進(jìn)行灌洗，待右心耳處流出清亮液體，表明灌洗充分。迅速斷頭取腦，于冰上分離腦海馬組織，放入液氮冷凍備用。

1.5 全基因組甲基化水平的檢測(cè) 每組取6 只小鼠海馬組織，使用通用型柱式基因組提取試劑盒提取海馬組織的基因組總DNA，測(cè)定DNA濃度；按照全基因組甲基化定量檢測(cè)試劑盒操作步驟，利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)全基因組甲基化水平。

1.6 PCR 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量-PCR（Real-time PCR）法檢測(cè)膿毒癥小鼠海馬組織DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs，包括DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b）的mRNA 水平。每組分別取6只小鼠海馬組織，采用Trizol 試劑提取各組織中RNA，測(cè)定RNA 濃度；按照cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書步驟將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；使用SYBR Green 法進(jìn)行模板的實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參。實(shí)時(shí)定量PCR 采用的引物序列見(jiàn)表1。按照SYBR Green Master Mix試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，采用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，共40 個(gè)循環(huán)。用Piko Real 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增并分析處理數(shù)據(jù)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 Primer sequence of Real-time-PCR表1 實(shí)時(shí)定量PCR 引物序列

1.7 Western blot 檢測(cè) DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b 蛋白表達(dá)水平 取海馬組織，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，4 ℃下14 000×g離心10 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。加入4×蛋白上樣緩沖液，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，用含吐溫20的磷酸鹽緩沖液（TBST）洗膜 3 次，加入 DNMT1（1∶1 000）、DNMT3a（1∶2 000）、DNMT3b（1∶3 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃ 孵育過(guò)夜。TBST洗膜后加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，底物化學(xué)發(fā)光顯影，使用Image J軟件分析灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值作為表達(dá)量檢測(cè)表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠全基因組DNA 甲基化水平比較 與Sham組比較，Sepsis 組1、3和7 d時(shí)全基因組甲基化水平均明顯降低（P＜0.05），與 Sepsis 組比較，Sepsis+H2組1、3 和7 d 時(shí)全基因組甲基化水平均明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 各 組 小 鼠 DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b 的mRNA 表達(dá)水平 建立模型后 1、3、7 d 時(shí) DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b 的 mRNA 表達(dá)水平發(fā)生了明顯的 改 變 。 與 Sham 組比較，Sepsis 組 1、3、7 d 時(shí)DNMT1 和 DNMT3a 的 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），DNMT3b 的 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與Sepsis 組比較，Sepsis+H2組1、3、7 d 時(shí)DNMT1 和 DNMT3a 的 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），DNMT3b 的 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 各組小鼠海馬組織DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，膿毒癥時(shí)小鼠海馬組織在1、3、7 d時(shí)DNMT1和DNMT3a的表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05），DNMT3b 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；氫氣治療后，Sepsis+H2組小鼠海馬組織在1、3、7 d時(shí)DNMT1和DNMT3a的表達(dá)水平比Sepsis 組降低（P＜0.05），DNMT3b 的表達(dá)水平較Sepsis組升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表2。

3 討論

Tab.2 Comparison of the expression levels of DNMT1,DNMT3a and DNMT3b at different time points between three groups表2 各組小鼠海馬組織DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表達(dá)的比較 （n=6，）

Tab.2 Comparison of the expression levels of DNMT1,DNMT3a and DNMT3b at different time points between three groups表2 各組小鼠海馬組織DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表達(dá)的比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Sepsis組比較，P＜0.05

組別Sham組Sepsis組Sepsis+H2組F DNMT1DNMT3a DNMT3b 1 d 0.14±0.02 0.21±0.03a 0.18±0.04ab 7.66＊＊3 d 0.15±0.03 0.22±0.04a 0.18±0.03ab 6.53＊＊7 d 0.16±0.03 0.24±0.05a 0.19±0.04ab 7.17＊＊1 d 0.12±0.01 0.46±0.07a 0.31±0.05ab 69.68＊＊3 d 0.13±0.02 0.65±0.09a 0.33±0.07ab 92.42＊＊7 d 0.13±0.02 0.68±0.08a 0.36±0.06ab 132.12＊＊1 d 0.18±0.03 0.08±0.02a 0.12±0.02ab 26.82＊＊3 d 0.16±0.02 0.08±0.01a 0.13±0.03ab 21.43＊＊7 d 0.17±0.03 0.07±0.02a 0.12±0.02ab 26.47＊＊

膿毒癥是急危重癥患者死亡的重要原因，SAE是膿毒癥患者的常見(jiàn)并發(fā)癥，能夠明顯提高患者病死率［10］，并可造成嚴(yán)重的急性和遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響患者治愈后的生活質(zhì)量［11-12］，SAE 的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，可能與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體和血管功能障礙、神經(jīng)傳遞障礙和細(xì)胞凋亡等有關(guān)［13-14］。氫氣是一種還原劑，具有抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡和促進(jìn)能量代謝等作用［15］，無(wú)論是吸入氫氣還是口服或注射富氫水對(duì)缺血/再灌注損傷、創(chuàng)傷、膿毒癥、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等多種不同動(dòng)物模型均有保護(hù)作用［16-17］。筆者前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明給膿毒癥小鼠吸入2%氫氣可明顯增加Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中小鼠在目標(biāo)象限時(shí)間的百分比和穿過(guò)站臺(tái)的次數(shù)，改善膿毒癥小鼠的認(rèn)知功能障礙，對(duì)SAE起到治療作用，其機(jī)制與氫氣可以減少腦海馬組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等炎癥因子表達(dá)水平，增加超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，降低丙二醛（MDA）和8-異前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）水平等有關(guān)，但是否與其他機(jī)制有關(guān)尚不十分明確［1］。

DNA 甲基化是一種表觀遺傳學(xué)修飾，其動(dòng)態(tài)變化貫穿于生命的始終，且對(duì)基因組的功能調(diào)控和穩(wěn)定性維持具有重要意義。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，DNA 甲基化對(duì)維持大腦的認(rèn)知功能起到重要作用，通過(guò)基因調(diào)控等機(jī)制參與了神經(jīng)突觸可塑性和認(rèn)知記憶的形成過(guò)程［18］，如果DNA 甲基化異常，則可導(dǎo)致中樞神經(jīng)退行性病變和功能障礙［19-20］。創(chuàng)傷應(yīng)激時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的DNA甲基化水平發(fā)生改變，通過(guò)調(diào)控Gdnf、Bdnf、Dlgap2、Gad、Reln 等突觸可塑性相關(guān)基因在海馬等區(qū)域的表達(dá)，影響神經(jīng)突觸可塑性和記憶能力，造成認(rèn)知功能障礙［21］。本研究結(jié)果顯示膿毒癥小鼠海馬組織全基因組DNA甲基化水平降低，在吸入氫氣后明顯升高，說(shuō)明在SAE 這種急性腦損傷情況下，DNA 甲基化狀態(tài)發(fā)生了改變，全基因組甲基化水平降低，吸入氫氣有明顯的改善作用，能夠一定程度上升高全基因組甲基化水平。

DNA的甲基化過(guò)程是在DNMTs的催化下，將甲基供體S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）中的甲基轉(zhuǎn)移到DNA特定堿基上，DNA甲基化可以發(fā)生在胞嘧啶的C-5 位、腺嘌呤的N-6 位及鳥嘌呤的N-7位等多個(gè)位點(diǎn)，但在高等真核細(xì)胞中DNA甲基化主要發(fā)生在CpG 中胞嘧啶的C-5 位，使其變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5mc）。DNMTs 主要包括DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b。DNMT1 在 DNA 復(fù)制的過(guò)程中，識(shí)別母鏈已甲基化的CpG位點(diǎn)，催化相應(yīng)子鏈上的CpG 位點(diǎn)甲基化，將母鏈的甲基化狀態(tài)復(fù)制到子鏈中，稱為維持甲基轉(zhuǎn)移酶，在成熟大腦中，DNMT1主要表達(dá)在有絲分裂后的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，主要作用是維持局部的甲基化狀態(tài)［22］；DNMT3a 和DNMT3b可將雙鏈DNA上未甲基化的CpG位點(diǎn)重新建立新的甲基化狀態(tài)，稱為重新甲基轉(zhuǎn)移酶，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中DNMT3a主要表達(dá)在發(fā)展、成熟的神經(jīng)元，以及少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞中，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜行為學(xué)功能起到關(guān)鍵作用，DNMT3b 則主要表達(dá)在胚胎及神經(jīng)前體細(xì)胞，在成熟神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)較少，但對(duì)突觸可塑性和記憶形成有一定的調(diào)節(jié)作用［23］。本研究結(jié)果顯示在1、3、7 d 時(shí)膿毒癥小鼠海馬組織DNMT1 和DNMT3a 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)，DNMT3b 的表達(dá)mRNA 和蛋白表達(dá)水平減弱，在吸入氫氣后，DNMT1 和DNMT3a 的表達(dá)減弱，DNMT3b的表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明膿毒癥時(shí)小鼠海馬組織內(nèi)的DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)發(fā)生了明顯的紊亂，并且吸入氫氣可以在一定程度上糾正這些紊亂。因此，筆者推測(cè)能夠糾正DNA甲基化的紊亂狀態(tài)是氫氣治療SAE的重要機(jī)制之一。

正常情況下，DNA 甲基化處于一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，有賴于甲基化和去甲基化過(guò)程的動(dòng)態(tài)平衡，去甲基化過(guò)程是指在去甲基化酶的作用下移除5mc上的甲基，使其重新變?yōu)榘奏さ倪^(guò)程［24］。本研究中膿毒癥組小鼠雖然在 1、3、7 d 時(shí) DNMT1 和DNMT3a的mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯增加，但全基因組DNA甲基化水平卻有不同程度的降低，可能與其他因素影響有關(guān)，如甲基供體不足，去甲基化酶活動(dòng)增強(qiáng)等，然而氫氣能夠糾正膿毒癥小鼠海馬組織DNA甲基化狀態(tài)的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，吸入氫氣能在一定程度上糾正膿毒癥小鼠海馬組織的DNA甲基化狀態(tài)的紊亂，升高全基因組DNA甲基化水平，使DNMT1和DNMT3a的表達(dá)增強(qiáng)，DNMT3b 的表達(dá)減弱。改善DNA 甲基化紊亂狀態(tài)是氫氣治療SAE的重要機(jī)制之一。