鐘瓊慧，黃波，盧婉，徐顏美，閔清華，李書琪，姜鈺環(huán)，林晉△，王小中△

肥胖及其相關(guān)疾病的發(fā)病率逐年上升，成為全球不可忽視的一大問題。白色脂肪組織（white adi?pose tissue，WAT）的過度聚集是導(dǎo)致肥胖的直接原因之一［1］。WAT 與棕色脂肪組織（brown adipose tis?sue，BAT）是共同存在于哺乳動物體內(nèi)的2種脂肪組織，前者通常以三酰甘油的形式儲存能量，而后者則通過解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP 1）介導(dǎo)的非寒戰(zhàn)形式產(chǎn)生熱量［2］。研究發(fā)現(xiàn)，WAT 可以向BAT轉(zhuǎn)換，拮抗肥胖的產(chǎn)生，這種轉(zhuǎn)變稱為白色脂肪棕色化，在這過程中過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）、含PR結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白16（positive reg?ulatory domain zinc finger protein 16，PRDM16）及過氧化物酶體增殖子激活受體γ 共激活因子1α（per?oxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）是最核心的調(diào)控因子［3-4］。外泌體作為一種存在于機體幾乎所有微環(huán)境中的新興的功能性物質(zhì)，能夠通過攜帶蛋白質(zhì)、信使核糖核酸（messen?ger ribonucleic acid，mRNA）、微小核糖核酸（microribonucleic acid，miRNA）等生物活性分子釋放到微環(huán)境中，充當(dāng)細胞間信息交流的中介，參與調(diào)節(jié)多種細胞生物學(xué)功能［5］。本研究旨在探討脂肪干細胞來源的外泌體通過攜帶高濃度miR-27 抑制白色脂肪棕色化的作用機制，以期為肥胖的研究及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性Balb/C小鼠3只，體質(zhì)量18.6～20.1 g，4周齡，由湖北省動物研究中心提供，用于分離培養(yǎng)脂肪干細胞（ASC）；SPF 級雄性C57BL/6 小鼠18 只，體質(zhì)量14.9～17.6 g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，3周齡，用于構(gòu)建肥胖模型及后期實驗。飼養(yǎng)環(huán)境均為溫度22～26 ℃，相對濕度50%～60%，人工光照明暗各12 h。人胚腎細胞系293T 細胞株，購自中國科學(xué)院細胞庫。低糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司），Ⅰ型膠原酶（Gibco 公司），多聚賴氨酸（Sigma 公司），流式檢測抗體CD34、CD45、CD105、CD133及Sca-1（eBioscience公司），質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGE 公司），T4 DNA 連接酶（TAKARA 公司），內(nèi)切酶BamHⅠ、內(nèi)切酶XbaⅠ（NEB 公司），Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen 公司），Western blot 抗 體 UCP1、PPARγ、PRDM16 及 PGC-1α（Bioswamp公司），倒置熒光顯微鏡（Leica公司），流式細胞儀（艾森公司），實時熒光定量核酸擴增（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀、水平電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定 SPF級雄性Balb/C小鼠3只,普通飲食，不經(jīng)特殊處理，斷頸處死小鼠，于75%乙醇中浸泡15 min，無菌條件下分離雙側(cè)腹股溝脂肪組織。將收集的脂肪組織剪碎后置于50 mL的離心管內(nèi)，加入適量的氯霉素，15 min 后用2～3 倍體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次。1 000 r/min 離心5 min 后棄上清，加入5 倍體積的0.1%膠原酶NB4，將離心管置于37 ℃恒溫汽浴搖床內(nèi)消化2 h，150目無菌網(wǎng)篩濾去未被消化的殘余組織。接著1 000 r/min離心5 min 棄上清，細胞沉淀用PBS 洗滌2 次，將收集的細胞用培養(yǎng)液重懸，以1×105個/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液，待細胞生長達到90%融合時，消化傳代。收集第3代細胞進行形態(tài)、表型的鑒定：倒置相差顯微鏡下（×40、×100、×200）觀察細胞的生長及形態(tài)學(xué)特點；用流式細胞儀檢測細胞CD34、CD45、CD105、CD133 及Sca-1抗原的表達。

1.2.2 外泌體的提取與鑒定 取第3 代ASC 細胞用低糖DMEM 培養(yǎng)液于5%CO2、37 ℃飽和濕度溫箱中進行擴增培養(yǎng)，所用胎牛血清在使用前均經(jīng)110 000×g超高速離心18 h以去除可能存在于血清中的外泌體。收集120 mL細胞培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)液，依照差次梯度超高速離心法提取外泌體［6］。提取的外泌體用PBS溶液重懸后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ饷隗w的鑒定包括透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)以及Western blot 技術(shù)檢測外泌體標志蛋白Alix 和TSG101 的表達（重復(fù)3次上樣）。

1.2.3 過表達miR-27載體的構(gòu)建 目的基因序列通過基因合成的方法獲取，將合成的DNA 片段及載體分別用內(nèi)切酶BamHⅠ、內(nèi)切酶XbaⅠ于37 ℃雙酶切3 h；雙酶切后目的基因片段與載體進行連接，16 ℃連接過夜，待長出菌落，挑取單個菌落，搖菌提取質(zhì)粒DNA。取對數(shù)生長期的293T細胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1.0×106個/mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h 待細胞密度達70%～80%時即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h 后更換培養(yǎng)基，48 h 和72 h 分別2 次收集病毒上清，收集后以0.45 μm濾器過濾，上清液加濃縮試劑（慢病毒液體積∶濃縮試劑體積=5∶1）4 ℃孵育過夜。完成孵育后，混合液于50 mL 超速離心管中4 ℃、3 500×g離心25 min。棄去上清，根據(jù)收集的慢病毒上清液體積，1/100～1/10體積的PBS重懸病毒沉淀，分裝后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 熒光顯微鏡驗證轉(zhuǎn)染效率及qRT-PCR 驗證miR-27表達量 慢病毒上清感染293T細胞，分為3組：對照組（不進行感染）、空載體組（加入空載體）及慢病毒過表達組（加入構(gòu)建的過表達miR-27載體），48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，以轉(zhuǎn)染效率最好的病毒液濃度作為最佳的病毒轉(zhuǎn)染滴度，計算病毒滴度=病毒顆粒數(shù)/病毒原液量。培養(yǎng)生長良好的ASC 細胞24 h 后，取病毒液以最佳滴度感染ASC，培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，提取獲得過表達miR-27的外泌體。提取總RNA，利用qRT-PCR 檢測miR-27 的表達量。按表1 序列進行引物構(gòu)建，反應(yīng)過程：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

Tab.1 Primer sequences of miR-27 and internal reference U6表1 miR-27及內(nèi)參U6的引物序列

1.2.5 動物實驗 C57BL/6 小鼠18 只在適宜的環(huán)境中普通喂食。適應(yīng)7 d后，每2 d以含45%脂肪飼料喂食。喂養(yǎng)8周構(gòu)建肥胖小鼠模型，并記錄體質(zhì)量，以肥胖度大于＞20%為造模成功［7］。將肥胖小鼠隨機均分為3組，每組6只：通過尾靜脈分別注射過表達miR-27 ASC 細胞分泌的外泌體（過表達組）、正常ASC 細胞外泌體（正常表達組）及生理鹽水（對照組），每2 d注射1次，共12 d；這期間3組繼續(xù)以高脂肪喂食6 d記錄體質(zhì)量，第7 d開始予以普通喂食，并且每天給予寒冷刺激1 h。第12 天記錄體質(zhì)量后，分離小鼠附睪皮下脂肪組織（即WAT）和肩胛骨脂肪組織（即BAT），檢測UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α的表達情況。

1.2.6 Western blot 檢測UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α 的表達 配制12%的分離膠、5%的濃縮膠。每孔上樣量為20 μg 蛋白。電泳：80 V 40 min，120 V 50 min，當(dāng)染料到達膠底部時即終止電泳，260 mA轉(zhuǎn)膜120 min（轉(zhuǎn)膜前將膜在甲醇中浸泡5 min）；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗室溫孵育1 h或4 ℃孵育過夜；洗滌3次，每次5 min。隨后根據(jù)用量，按照1∶10 000 稀釋二抗，與膜室溫孵育1 h，洗滌3 次，每次5 min。之后進行ECL化學(xué)發(fā)光檢測，通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量的方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASC細胞的形態(tài)觀察與鑒定 ASC剛貼壁的細胞呈圓形，培養(yǎng)24 h后細胞呈長梭形；培養(yǎng)第3代的ASC 的形態(tài)，見圖1。流式細胞儀檢測顯示，CD34、CD45、CD133 低表達，陽性率分別為6.43%、6.35%、0.09%；CD105 與 Sca-1 高表達，陽性率為 93.71%、92.62%，見圖2。

2.2 外泌體的鑒定 分離的外泌體透射電鏡下呈囊泡狀，大小為30～120 nm，見圖3A；Western blot 檢測示，提取物表達外泌體標志蛋白Alix 和TSG101，見圖3B；qRT-PCR 檢測示，脂肪干細胞（5.65±0.78）及脂肪干細胞外泌體（5.26±0.67）中miR-27 表達量高于白色脂肪組織（1.00±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=56.661，P＜0.001）。

2.3 miR-27轉(zhuǎn)染效率 慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞48 h后，當(dāng)病毒滴度為5×108TU/mL 時，光學(xué)顯微鏡下顯示細胞生長良好（圖4A、B、C），熒光顯微鏡下顯示慢病毒密度高（圖4D、E），以此滴度為病毒最佳轉(zhuǎn)染滴度。轉(zhuǎn)染ASC 細胞后的對照組、空載體組及過表達組的 miR-27 的表達量分別為（1.00±0.02）、（1.02±0.02）、（39.68±0.31），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=44 357.091，P＜0.001）。

2.4 外泌體攜帶miR-27對小鼠體質(zhì)量與脂肪組織體積的影響 過表達miR-27 對小鼠的體質(zhì)量變化無明顯影響，相同時點3 組間的體質(zhì)量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。3組干預(yù)后12 d的小鼠體質(zhì)量與干預(yù)前的體質(zhì)量的減少量分別為：對照組（3.32±1.36）g、過表達組（1.12±0.43）g、正常表達組（1.75±0.31）g，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.878，P＜0.01）。相對于對照組，過表達組與正常表達組小鼠分離的WAT 體積要大，且過表達組更明顯；而BAT的大小變化不明顯，見圖5。

Tab.2 Changes in body weights of three groups of mice表2 各組小鼠體質(zhì)量變化情況 （g，）

Tab.2 Changes in body weights of three groups of mice表2 各組小鼠體質(zhì)量變化情況 （g，）

F時間=69.108，F(xiàn)交互=7.370，P＜0.05；F組間=0.628，P＞0.05

組別對照組過表達組正常表達組n6 6 6干預(yù)前30.82±2.44 29.93±3.02 31.48±3.25注射后6 d 29.60±2.00 29.25±2.49 31.03±3.25注射后12 d 27.50±1.35 28.82±2.80 29.73±3.30

2.5 外泌體攜帶miR-27對UCP1、PPARγ、PRDM16及PGC-1α 的影響 對照組、正常表達組與過表達組的UCP1、PPARγ、PRDM16及PGC-1α相對表達水平呈依次降低趨勢（P＜0.05），見表3、圖6。

Tab.3 Comparison of expression levels of UCP1,PPARγ,PRDM16 and PGC-1α between the three groups表3 各組小鼠中UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α的表達水平比較 （n=3，）

Tab.3 Comparison of expression levels of UCP1,PPARγ,PRDM16 and PGC-1α between the three groups表3 各組小鼠中UCP1、PPARγ、PRDM16、PGC-1α的表達水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與對照組比較，b 與正常表達組比較，P＜0.05

組別對照組正常表達組過表達組F UCP1 0.61±0.01 0.59±0.01a 0.30±0.02ab 663.946＊＊PPARγ 0.77±0.02 0.66±0.01a 0.35±0.02ab 535.571＊＊PRDM16 0.37±0.02 0.33±0.01a 0.23±0.01ab 75.941＊＊PGC-1α 0.50±0.01 0.38±0.01a 0.26±0.01ab 534.125＊＊

3 討論

WAT被認為是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌器官，通過產(chǎn)生多種脂源性細胞因子調(diào)節(jié)復(fù)雜的生理過程，維持系統(tǒng)能量平衡［8］。BAT主要生理學(xué)功能是產(chǎn)生和釋放熱量，對維持機體能量平衡也有重要作用［9］。ASC來源的外泌體內(nèi)含大量的遺傳信息，通過自分泌或旁分泌的方式對鄰近或遠處的靶細胞發(fā)揮其調(diào)控作用［10］。因此，如何調(diào)控外泌體的產(chǎn)量及控制其攜帶的遺傳信息對WAT的影響，對于理解白色脂肪棕色化的進程及肥胖控制有至關(guān)重要的意義。

miRNA 可以從供體細胞傳遞到遠端的受體細胞，以內(nèi)分泌或旁分泌的方式向特異靶組織細胞傳遞調(diào)節(jié)信號，改變靶組織某些基因的表達，因此其可以作為疾病診斷的生物標志物［11］。筆者團隊前期也證實了ASC 富含微囊泡（包括外泌體），且攜帶豐富的miRNA，具有促進血管生成、腫瘤發(fā)展的生物學(xué)作用［6］。有研究表明miR-27 在抗腫瘤方面的作用也不可小覷，包括誘導(dǎo)食管癌、肝癌、胃癌、胰腺癌細胞凋亡［12］，抑制肺癌細胞增殖［13］，參與前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤的疾病進展等，這提示miR-27 可能成為治療或預(yù)防腫瘤的靶標，而ASC 來源的外泌體可能成為未來攻克腫瘤難題的新方向。

研究顯示，miR-27 可以直接抑制PPARγ 基因，影 響 線 粒 體 功 能［14］；miR-27 通 過 靶 向 調(diào) 節(jié)PRDM16，進而參與脂肪棕色化調(diào)控［15］。同時有研究發(fā)現(xiàn)miR-27a/PPARγ/β-catenin 軸激活也可促進糖尿病腎病的發(fā)展，主要是引起足細胞損傷，使血流動力學(xué)因子改變，刺激系膜細胞胞外基質(zhì)的合成增加［16］。在脂肪細胞分化過程中，miR-27能夠直接靶向結(jié)合抗增殖蛋白（prohibitin，PHB），引起線粒體結(jié)構(gòu)變化及功能障礙，從而抑制脂肪細胞的分化［17］。由此可見，miR-27可以在多位點參與調(diào)控脂肪代謝過程，具有調(diào)控白色脂肪棕色化的潛能。但關(guān)于外泌體這一具有生物傳導(dǎo)的活性物質(zhì)，卻鮮有研究其中的miR-27 的含量及其對脂肪組織轉(zhuǎn)化、代謝的作用。

研究顯示，肥胖狀態(tài)下血清中升高的miR-27主要來源于脂肪細胞分泌［18］，且通常作為一種負向調(diào)控因子來抑制脂肪細胞分化［19］。本研究結(jié)果顯示，ASC 及其外泌體中的miR-27 顯著高于WAT，證實ASC 可能是研究miR-27 功能與機制的良好材料來源。另有研究認為，肥胖小鼠中的WAT 中miR-27含量下降，而體循環(huán)中miR-27 則呈現(xiàn)上調(diào)趨勢［18］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)此種現(xiàn)象，這可能與脂肪干細胞分泌外泌體并攜帶miR-27進入體循環(huán)有關(guān)，進而影響或調(diào)控脂肪的代謝。以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-27主要靶向PPARγ 的表達來抑制脂肪沉積［20］。而本研究發(fā)現(xiàn)，miR-27 可以抑制PPARγ 的表達，但主效應(yīng)是抑制白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)變，使得白色脂肪消耗減少，呈現(xiàn)出肥胖小鼠體質(zhì)量下降緩慢。小鼠WAT體積增大，這可能與miR-27 對其他棕色化相關(guān)蛋白（UCP1、PRDM16、PGC-1α）的抑制作用更強有關(guān)，對BAT合成的抑制作用強于WAT的消耗。

綜上所述，miR-27能夠由ASC以外泌體形式分泌，且能夠被脂肪細胞所攝??；ASC以外泌體形式分泌的miR-27能夠抑制白色脂肪棕色化，該抑制作用主要通過轉(zhuǎn)運miR-27 下調(diào)UCP1、PPARγ、PRDM16及PGC-1α棕色化相關(guān)蛋白的表達完成。