龍脈，李夢婕，柯本，黃金菁，房向東

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患病率逐年上升，已成為全球公共衛(wèi)生與健康問題［1］。腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種不同病因CKD 進行性發(fā)展至終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）的共同病理狀態(tài)，其特征性病變?yōu)槟I小管萎縮、大量炎性細胞浸潤、肌成纖維細胞活化，導致細胞外基質成分過度堆積，最終取代正常腎臟結構，造成腎臟功能不全與喪失［2］。大黃素（emodin，EM）是中藥大黃的有效活性成分，屬于蒽醌類物質，具有抑菌、抗炎、調節(jié)免疫、抗腫瘤、保肝利膽、利尿、改善腎功能等藥理作用［3］。研究認為，大黃素可以改善大鼠腎臟纖維化［4］，但是大黃素長期給藥會對小鼠腎臟產生毒性作用［5］。線粒體融合蛋白2（mitofusin2，Mfn2）是線粒體外膜上的跨膜蛋白，主要參與線粒體外膜融合，在線粒體能量代謝、細胞葡萄糖水平、細胞增殖、凋亡、自噬等方面發(fā)揮著重要作用［6］。線粒體功能障礙及功能受損參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展［7］，Mfn2 過表達下調了膠原蛋白Ⅳ的表達，顯示出對糖尿病腎病的保護作用［8］。目前關于Mfn2 在腎臟纖維化中的研究少見。本研究旨在探討在轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）刺激后人腎小管上皮HK-2 細胞中Mfn2 的表達水平，觀察大黃素干預后Mfn2的表達水平變化，探討大黃素對腎臟纖維化的保護作用機制及其與線粒體功能的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 HK-2細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清（以色列BI公司，04-001-1-A），重組人TGF-β1（美國Peprotech公司，100-21），大黃素（Sigma，E7881），CCK-8試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，BA00208），RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）及Western blot 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），兔抗Mfn2單克隆抗體（英國Abacm 公司，ab124773），兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）多克隆抗體、兔抗結締組織生長因子（CTGF）多克隆抗體及兔抗E-鈣黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，貨號分別為bs-10196R、bs-0743R、bs-1519R），兔抗GAPDH 多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，10494-1-AP），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（博士德生物工程公司，BA1060），CO2培養(yǎng)箱（SANYO，MCO-15AC），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS-CX41），SDS-PAGE微型凝膠電泳及轉膜設備（美國BIO-RAD 公司），全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-5200），低溫高速離心機（德國Sartorius-3k30）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HK-2 細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入1%的青霉素和鏈霉素雙抗，于37 ℃，5%CO2條件下進行培養(yǎng)，細胞融合至80%，0.25%胰蛋白酶消化，隔天換液，2～3 d 傳代 1 次，取對數(shù)生長期HK-2 細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 大黃素母液 精確稱取大黃素10 mg，并用666.67 μL的DMSO超聲溶解，得到濃度為50 mmol/L的大黃素母液，使用時DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋。

1.2.3 CCK-8 法檢測大黃素對HK-2 細胞增殖活性的影響 在96孔板中接種HK-2細胞懸液（每孔100 μL，約5 000個細胞），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁，融合至50%左右，棄去上清用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，換無血清培養(yǎng)基饑餓。24 h后棄去無血清培養(yǎng)基，向各孔中加入不同濃度（0、10、20、40、80、160 μmol/L）的大黃素溶液，設置空白對照組，每組設5個平行復孔。將培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避免產生氣泡，放培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度（A）值。計算：細胞存活率（%）=［A（加藥）-A（空白）］/［A（0 加藥）-A（空白）］×100%。實驗重復3次。

1.2.4 實驗分組及干預 根據(jù)CCK-8實驗結果，為避免高濃度EM 干預對HK-2 細胞活性的影響，最終選擇濃度為10、20、40 μmol/L 的EM 進行后續(xù)實驗。因此，實驗分空白對照組、TGF-β1 組、TGF-β1+EM（10、20、40 μmol/L）組。培養(yǎng)HK-2 細胞，將細胞接種在6 孔板中，待細胞融合至50%左右，換無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，大黃素干預組加入不同濃度EM，30 min 后 TGF-β1 組和各濃度大黃素干預組給予 10 μg/L 的TGF-β1刺激48 h，收集細胞進行Western blot免疫印跡分析。

1.2.5 Western blot法檢測Mfn2、α-SMA、CTGF及E-cadherin蛋白表達 各組6 孔板中的細胞用預冷的PBS 清洗2 遍，加入RIPA裂解液，刮取細胞提取總蛋白，取上清后采用BCA法進行蛋白定量，余蛋白樣品加6×蛋白上樣緩沖液，金屬浴100 ℃變性6 min。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白（75 V 30 min，110 V 65 min），濕轉（200 mA，90 min），5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，孵育一抗，Mfn2（1∶2 000），α-SMA（1∶2 000），CTGF（1∶2 000），E-cadherin（1∶1 000），GAPDH（1∶50 000），4 ℃搖床過夜。次日，洗膜、室溫孵育辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶8 000）1 h，洗膜，ECL 顯影液曝光，Image J軟件進行半定量分析。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，2組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度大黃素對HK-2細胞增殖的影響 0、10、20、40、80、160 μmol/L 的大黃素處理組的HK-2細胞的存活率（%）分別為100.00±0.00、90.89±2.17、88.52±1.67、87.72±2.00、63.46±1.73、52.19±2.60，呈逐漸降低趨勢（n=3，F(xiàn)=287.553，P＜0.01）。

2.2 TGF-β1 刺激后HK-2 細胞中上皮間質轉分化（EMT）相關蛋白E-cadherin、α-SMA、CTGF 表達的變化 與空白對照組相比，TGF-β1 組α-SMA 及CTGF蛋白水平升高，E-cadherin蛋白表達降低（P＜0.05），見表1、圖1。

Tab.1 Expression levels of EMT-related proteins after TGF-β1 stimulation in HK-2 cells表1 TGF-β1刺激后HK-2細胞EMT相關蛋白表達水平（n=3，）

Tab.1 Expression levels of EMT-related proteins after TGF-β1 stimulation in HK-2 cells表1 TGF-β1刺激后HK-2細胞EMT相關蛋白表達水平（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對照組TGF-β1組t E-cadherin 1.000±0.000 0.706±0.046 11.065＊＊Mfn2 1.000±0.000 1.590±0.134 7.614＊α-SMA 1.000±0.000 1.199±0.077 4.473＊CTGF 1.000±0.000 1.337±0.088 6.665＊

2.3 大黃素對TGF-β1 誘導的HK-2 細胞中E-cadherin、α-SMA、CTGF 蛋白表達的影響 與TGF-β1組相比，給予各濃度大黃素干預后，HK-2細胞中α-SMA 及 CTGF 蛋白水平降低，E-cadherin 蛋白表達升高（P＜0.05），且大黃素濃度越高，作用越明顯，見表2、圖1。

2.4 大黃素對TGF-β1誘導的HK-2細胞中Mfn2蛋白表達的影響 與空白對照組相比，TGF-β1 刺激后，HK-2 細胞中Mfn2 蛋白表達增加（P＜0.05），各濃度大黃素干預后，Mfn2蛋白表達水平較單純給予TGF-β1 刺激時表達減少（P＜0.01），且大黃素濃度越高，抑制作用越明顯，見表1、2，圖1。

3 討論

近年來，盡管CKD 治療取得一定的進展，目前仍無特效藥物或其他手段對CKD 患者進行有效根治性治療，伴隨腎間質纖維化的進展，最終發(fā)展為終末期腎?。?］。腎間質纖維化是CKD的最常見病理表現(xiàn)，主要特征為成纖維細胞的增殖、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的積累以及腎單位功能性喪失［2］。腎小管上皮細胞EMT是活化的肌成纖維細胞的重要來源之一，是RIF的核心環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為上皮細胞失去黏附能力、α-SMA表達和肌動蛋白的重組、基底膜破壞、細胞遷移和侵襲能力增強［10］。TGF-β1為公認的促纖維化因子，可刺激腎小管上皮細胞的EMT，促進RIF 的進展［11］。在TGF-β1 誘導后，腎小管上皮細胞發(fā)生表型轉化，上皮標志蛋白E-cadherin 表達減少，間充質標志蛋白α-SMA 表達增加［12］。結締組 織 生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）作為一種促纖維化因子，可通過與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結合，調節(jié)成纖維細胞ECM 的合成和誘導腎小管上皮細胞的 EMT 產生［13］。Wong 等［14］研究認為，外源性TGF-β1誘導成纖維細胞后CTGF表達水平升高，體內外CTGF的表達依賴TGF-β1信號通路，CTGF 是TGF-β1 的下游信號分子。因此，E-cadherin、α-SMA 和 CTGF 蛋白都是發(fā)生 EMT 時的標志蛋白。本實驗結果顯示，與空白對照組相比，在給予TGF-β1誘導后，Western Blot檢測到HK-2細胞中α-SMA和CTGF蛋白表達增多，E-cadherin蛋白表達減少，表明TGF-β1 刺激后HK-2 細胞發(fā)生了EMT，提示成功建立了腎小管上皮細胞EMT模型。

大黃素為中藥大黃的有效成分之一，在腎臟中有著利尿及改善腎功能的藥理作用［3］。越來越多的研究表明，大黃素對腎臟具有保護及治療作用。Ma等［4］研究認為，大黃素可能通過下調TGF-β1/Smad信號通路改善大鼠腎臟纖維化，顯示出大黃素的抗腎臟纖維化作用。Guan等［15］研究發(fā)現(xiàn)，大黃素通過抑制TGF-β1 信號傳導并隨后抑制EMT、成纖維細胞活化和ECM沉積，來減輕博來霉素（BLM）誘導的肺纖維化。另外，竇芳等［16］研究表明，大黃素通過抑制 Akt/mTOR 通路，改善 TGF-β1 誘導的 HK-2 細胞纖維化相關蛋白的表達，減少細胞損傷，從而延緩腎纖維化進展。本研究結果顯示，不同濃度的大黃素均對HK-2 細胞的增殖有抑制作用，但是以80、160 μmol/L 濃度的抑制作用更加明顯，考慮到高濃度大黃素對HK-2 細胞的毒性作用，因此以10、20、40 μmol/L 濃度進行后續(xù)的實驗。結果顯示，在HK-2細胞中給予TGF-β1刺激后，發(fā)生了EMT，在給予大黃素干預后，α-SMA 和CTGF 蛋白表達減少，E-cadherin蛋白表達增加，表明大黃素明顯改善了腎小管上皮細胞EMT，從而顯示出其抗腎臟纖維化作用。此外，大黃素濃度越高，抑制作用越明顯，顯示出劑量依賴性。

Tab.2 Expression levels of E-cadherin,α-SMA,CTGF and Mfn2 in HK-2 cells表2 各組HK-2細胞中E-cadherin、α-SMA、CTGF 、Mfn2蛋白表達水平 （n=3，）

Tab.2 Expression levels of E-cadherin,α-SMA,CTGF and Mfn2 in HK-2 cells表2 各組HK-2細胞中E-cadherin、α-SMA、CTGF 、Mfn2蛋白表達水平 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與TGF-β1對照組比較，b與TGF-β1（10）組比較，c與TGF-β1（20）組比較，P＜0.05

組別TGF-β1組TGF-β1+EM（10）組TGF-β1+EM（20）組TGF-β1+EM（40）組F E-cadherin 0.706±0.046 0.893±0.054a 0.995±0.033ab 1.171±0.075abc 38.520＊＊α-SMA 1.199±0.077 1.021±0.073a 0.905±0.026ab 0.785±0.053abc 25.108＊＊CTGF 1.337±0.088 0.878±0.049a 0.744±0.071ab 0.580±0.064abc 65.947＊＊Mfn2 1.590±0.134 1.252±0.123a 0.766±0.091ab 0.554±0.046abc 60.649＊＊

Mfn2是一種高度保守的跨膜GTP酶類，廣泛表達于心、腎、骨骼肌、肝、腦等組織器官，尤以心、腎和腦最為豐富。Mfn2定位于細胞內線粒體外膜，具有促進線粒體融合和維持線粒體正常結構的功能，在高血壓、冠心病、內分泌疾病、腫瘤等多種疾病中發(fā)揮著關鍵作用［17］。在糖尿病腎病大鼠模型中，Mfn2的過表達減輕了模型大鼠的腎臟病理改變，抑制了膠原蛋白Ⅳ的合成，改善了氧化應激和線粒體功能，在糖尿病腎病早期起著保護作用［18］。目前，還少見關于Mfn2與腎纖維化方面的進展。本研究中，與空白對照組相比，在給予TGF-β1 誘導后的腎小管上皮細胞中，Mfn2蛋白水平升高，給予大黃素干預后，Mfn2 蛋白水平又隨之降低，且大黃素濃度越高，抑制作用越明顯，表明在腎小管上皮細胞發(fā)生EMT時，Mfn2 表達上調，而大黃素的干預又使Mfn2 表達下降，因此，筆者考慮大黃素可能會通過減少TGF-β 1誘導的Mfn2表達來改善腎臟纖維化。

綜上所述，TGF-β1 可以誘導HK-2 細胞發(fā)生EMT；大黃素能顯著逆轉 TGF-β1 誘導的HK-2 細胞轉分化作用，保護受損的HK-2細胞，早期阻斷這一過程可能預防或延緩腎間質纖維化的發(fā)生；Mfn2表達水平在腎小管上皮細胞發(fā)生EMT后發(fā)生改變，提示Mfn2及線粒體功能與腎臟纖維化的密切聯(lián)系，其可能是腎臟發(fā)生纖維化的早期生物標志物；大黃素能降低EMT后Mfn2的表達水平，可能通過調節(jié)線粒體功能來減緩腎臟纖維化，發(fā)揮腎臟保護作用。