邢漢君，吳民熙,，郭照輝,，方雅瑜，羅容珺,，伍善東,，單世平,，冉啟洋

(1.湖南恒凱環(huán)?？萍纪顿Y有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3.持久性有機(jī)污染微生物生態(tài)修復(fù)湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 4100004.湖南省有機(jī)污染場(chǎng)地修復(fù)工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

隨著全球工業(yè)化的迅速發(fā)展，石油和石油產(chǎn)品已經(jīng)成為工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中的主要能源來(lái)源，石油使用量急劇增加，每年產(chǎn)量約為4×109t[1]。但在石油的開(kāi)采、運(yùn)輸、加工和使用過(guò)程中，部分石油進(jìn)入周邊土壤甚至地下水，造成石油污染，嚴(yán)重危害人類健康，其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)難以預(yù)估[2]。探索有效的石油污染修復(fù)治理技術(shù)已成為國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注重點(diǎn)。

石油污染物主要成分為石油烴，包含鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴，其中又以烷烴居多，約占石油烴總含量的50%以上[3]。短鏈烷烴(如甲烷)一般以氣體形態(tài)存在，易揮發(fā)，正十六烷等中長(zhǎng)鏈烷烴較難在環(huán)境中降解，易污染周邊環(huán)境，是較常見(jiàn)的石油污染源。目前，石油污染物的修復(fù)方法主要包括物理法、化學(xué)法和生物法。相較于物理法和化學(xué)法，生物法具有成本較低、對(duì)原環(huán)境擾動(dòng)較小、無(wú)二次污染等特點(diǎn)[4-6]。研究[7-9]表明，在適宜條件下大多數(shù)石油烴均能被微生物代謝、降解。因此，篩選出能夠高效降解石油烴的微生物，成為微生物治理石油污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

作者通過(guò)富集培養(yǎng)，從長(zhǎng)沙某地長(zhǎng)期受石油污染的土壤中馴化篩選出一株能利用正十六烷作為碳源和能源的菌株，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析等對(duì)其進(jìn)行鑒定，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究了不同培養(yǎng)條件(初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量和正十六烷初始濃度)對(duì)菌株 YJ1生長(zhǎng)的影響及其對(duì)正十六烷的降解性能。旨在為石油污染場(chǎng)地微生物治理技術(shù)提供理論指導(dǎo)與技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

土壤樣品：采集長(zhǎng)沙某動(dòng)力配件廠油庫(kù)及其周邊長(zhǎng)期受油料污染的表層(0～12 cm)土壤，放入無(wú)菌自封袋中，冰袋保溫，送回實(shí)驗(yàn)室后立即置于4 ℃冰箱保存。

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑，TAKARA公司；柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒，上海生工生物有限公司；通用引物，上?？道噬锟萍加邢薰?；石油醚、正十六烷等試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 1.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31.0 g，CaCl20.02 g，F(xiàn)e2(SO4)30.02 g，正十六烷 10 mL，蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

正十六烷無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：1 L無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加入正十六烷10 mL。

牛肉膏蛋白胨(BP)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株的富集、純化與篩選

將采集的10 g土壤樣品加到含適量正十六烷無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，于30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)5 d；吸取5 mL富集液置于95 mL新鮮的正十六烷無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離和純化，重復(fù)上述步驟。將純化得到的單菌落轉(zhuǎn)接入相應(yīng)的無(wú)機(jī)鹽斜面上，于4 ℃冰箱中保存。

1.3 菌株的鑒定

菌株形態(tài)特征以及生理生化特征鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]?；蛐蛄蟹治霾捎?6S rDNA進(jìn)行[11]，送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在Genbank進(jìn)行對(duì)比分析后，通過(guò)ClustalX 2.0和MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 菌株的生長(zhǎng)特性

1.4.1 生長(zhǎng)曲線的繪制

將篩選出的菌株用0.85%生理鹽水進(jìn)行稀釋，直至菌懸液OD600值為 0.1時(shí)，吸取1 mL菌懸液接入99 mL BP培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取一次樣，用分光光度計(jì)測(cè)定OD600值，做3個(gè)重復(fù)。以O(shè)D600值表示該菌株的生物量。

1.4.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

以正十六烷作為唯一碳源，分別考察初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%)和正十六烷初始濃度(2 mL·L-1、5 mL·L-1、10 mL·L-1、15 mL·L-1、20 mL·L-1)對(duì)篩選菌株生長(zhǎng)的影響。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的篩選菌株接種至含正十六烷的100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別在不同培養(yǎng)條件下180 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)期間每天觀察菌株生長(zhǎng)情況，每隔2 d用分光光度計(jì)測(cè)定OD600值，每組設(shè)3個(gè)平行。

1.5 菌株對(duì)正十六烷的降解率測(cè)定

菌株降解正十六烷實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株按10%的接種量接入以10 mL·L-1正十六烷為碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(pH=7)中，于30 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)；以不加菌株為對(duì)照，分別恒溫振蕩培養(yǎng)5 d、10 d、15 d。整瓶提取培養(yǎng)液，用石油醚萃取后，測(cè)定對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下的吸光度，計(jì)算降解率，取樣分析正十六烷殘留量，每組設(shè)3個(gè)平行。

正十六烷標(biāo)準(zhǔn)曲線：將待測(cè)溶液經(jīng)萃取后定容，測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得正十六烷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.1969x-0.2173，R2=0.9976。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的形態(tài)、生理生化特征及分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)篩選從土壤樣品中分離得到一株能以正十六烷為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，命名為YJ1，菌株形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖 1 菌株YJ1在BP平板(a)和光學(xué)顯微鏡下(b)的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain YJ1 on BP plate(a) and under optical microscope(b)

菌株YJ1在BP培養(yǎng)基中菌落呈淡黃色，凸起，邊緣齊整，表面濕潤(rùn)，不易挑起(圖1a)；菌株YJ1在光學(xué)顯微鏡下呈直桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性(圖1b)。

菌株YJ1的生理生化特征見(jiàn)表1，化學(xué)敏感試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表 1菌株YJ1的生理生化特征

Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain YJ1

注：“+”為陽(yáng)性反應(yīng)，“-”為陰性反應(yīng)。

表2菌株YJ1的化學(xué)敏感試驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of chemical sensitivity of strain YJ1

注：“-”為不敏感，“+”為敏感。

將測(cè)得的菌株YJ1的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)和同源性分析，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)多個(gè)菌株序列的同源性較高，序列相似度達(dá)到79%。

圖 2 基于16S rDNA序列構(gòu)建菌株YJ1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain YJ1 based on 16S rDNA gene sequences

通過(guò)對(duì)菌株YJ1的形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，初步確定菌株YJ1屬于細(xì)菌，在生物學(xué)上的分類屬于短芽孢桿菌屬。

2.2 菌株的生長(zhǎng)曲線(圖3)

從圖3可以看出，0～10 h為菌株YJ1的生長(zhǎng)延遲期，10～32 h為菌株YJ1的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，32～42 h為菌株YJ1的生長(zhǎng)穩(wěn)定期。當(dāng)菌株進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期至穩(wěn)定期時(shí)，測(cè)得的吸光度較高，表明此時(shí)菌株YJ1的生長(zhǎng)繁殖能力較強(qiáng)，培養(yǎng)基中細(xì)菌總量較多。從44 h開(kāi)始菌株YJ1進(jìn)入衰亡期，由于前一階段細(xì)菌的大量繁殖，使得此時(shí)培養(yǎng)基中的以正十六烷為主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本被消耗完，培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌的平均死亡速率遠(yuǎn)快于其生長(zhǎng)速率，造成細(xì)菌總量減少。

圖3 菌株YJ1的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of strain YJ1

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株YJ1生長(zhǎng)的影響(圖4)

pH值對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響主要表現(xiàn)在：一方面影響細(xì)胞質(zhì)膜的透性和穩(wěn)定性；另一方面通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解性或電離性影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響微生物的生長(zhǎng)速率[14]。從圖4a可以看出，菌株YJ1對(duì)初始pH值的適應(yīng)范圍較小，僅在初始pH值為6～8之間生長(zhǎng)較好，在堿性條件(pH=9)下的生物量要大于酸性條件(pH=5)。菌株YJ1生長(zhǎng)的最適初始pH值為7。

從圖4b可以看出，培養(yǎng)溫度過(guò)高或過(guò)低對(duì)菌株YJ1的生長(zhǎng)影響較大，40 ℃時(shí)，菌株YJ1幾乎停止生長(zhǎng)；20 ℃時(shí)，菌株YJ1也生長(zhǎng)緩慢。但培養(yǎng)溫度為30 ℃、35 ℃時(shí)，菌株生物量明顯高于其它溫度條件下的，其中培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)菌株YJ1生長(zhǎng)最佳。

圖4 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株YJ1生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of different culture conditions on growth of strain YJ1

從圖4c可以看出，菌株YJ1在不同接種量的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d后都迅速生長(zhǎng)，接種量大小與菌株生長(zhǎng)呈正比關(guān)系，即接種量越大，菌株的生物量越多，即菌株適應(yīng)環(huán)境的能力越強(qiáng)。其中接種量為10%的菌株YJ1生物量是接種量為2%的生物量的3倍左右，而菌株YJ1在接種量為2%的培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d后才逐步適應(yīng)環(huán)境，生物量有所增加，6 d后生物量逐步下降。菌株YJ1生長(zhǎng)的最適接種量為10%。

從圖4d可以看出，在各正十六烷初始濃度條件下，培養(yǎng)0～6 d,菌株YJ1生物量快速增加。正十六烷作為菌株唯一的碳源，濃度越高可被菌株利用的物質(zhì)就越多，所篩選菌株YJ1能很好地利用正十六烷。但培養(yǎng)10 d時(shí)，20 mL·L-1濃度的菌株生物量較其它濃度(除2 mL·L-1濃度外)的生物量低，可能是底物充足條件下，菌株大量代謝作用產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物對(duì)菌株產(chǎn)生一定的毒害，導(dǎo)致菌株活力減弱，生物量下降。菌株YJ1生長(zhǎng)的最適正十六烷初始濃度為10 mL·L-1。

2.4 降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

菌株YJ1培養(yǎng)不同時(shí)間后對(duì)正十六烷的降解率見(jiàn)圖5。

圖5 菌株YJ1培養(yǎng)不同時(shí)間后對(duì)正十六烷的降解率Fig.5 Degradation rate of n-hexadecane by strain YJ1 cultured for different time

菌株YJ1以正十六烷為唯一碳源進(jìn)行代謝活動(dòng)，不斷消耗培養(yǎng)基內(nèi)的碳源。從圖5可以看出，菌株YJ1在正十六烷初始濃度為10 mL·L-1的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)5 d、10 d、15 d時(shí)，對(duì)正十六烷的降解率分別為11.5%、63.5%、66.7%，可見(jiàn)隨著細(xì)菌生物量增加，溶液中碳源減少，有毒副產(chǎn)物增加，導(dǎo)致降解率上升緩慢。同時(shí)說(shuō)明所篩選菌株YJ1對(duì)正十六烷具備較強(qiáng)的降解能力。

3 結(jié)論

從長(zhǎng)沙某長(zhǎng)期受油料污染土壤中馴化篩選得到一株正十六烷降解菌YJ1，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析等對(duì)其進(jìn)行鑒定，初步確定菌株 YJ1屬于短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定菌株YJ1的最適培養(yǎng)條件為：初始pH值7、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量10%、正十六烷初始濃度10 mL·L-1。在最適條件下培養(yǎng)15 d，菌株YJ1對(duì)正十六烷的降解率可達(dá)66.7%，降解效果良好。綜合菌株的生長(zhǎng)條件和降解能力，初步認(rèn)為菌株YJ1較適用于類似石油污染中正十六烷污染修復(fù)。